MiRNAs as regulators of gene expression modulate development and energy metabolism of skeletal muscle

Abstract

It is important to understand the molecular networks affecting biological properties of muscle in order to improve the efficiency of meat production and meat quality in domestic animals. The discovery of miRNA represents an important breakthrough in biology in recent years. MiRNA function identification has become one of the active research fields in muscle biology addressing muscle development, growth and metabolism. This thesis aims at the identification of miRNAs differentially expressed in skeletal muscle at various developmental stages and in pig breeds differing in muscularity. Moreover, links between miRNAs and mRNAs should be shown in order to address biofunctions affected by miRNAs in muscle. Finally, miRNAs impacted on muscle metabolism should be validated exemplarity by in vitro cell culture experimants.<br /> The first approach demonstrates the comprehensive miRNA expression profiles of longissimus dorsi (LD) during muscle development and growth. A comparative study on two distinct phenotypic pigs were performed using miRNA custom designed arrays. Two different key stages 63 and 91 days post-conception (dpc), and one adult stage (180 days post-natum) were analysed in German Landrace (DL) and Pietrain (Pi) breeds. Several potential candidate miRNAs are significantly up-regulated and associated with muscular developmental stages and breed types. The Affymetrix GeneChip porcine genome microarrays were also used to obtain the differential transcriptional profile of mRNA targets of the same animals. The combination of miRNA–mRNA expression data and Ingenuity Pathway Analysis established complex miRNA–dependent regulatory networks. A number of miRNA–mRNA interactions, that were associated to cellular growth and proliferation and lipid-metabolism functions, revealed insights into their role during skeletal muscle development and growth.<br /> The second approach involves in muscle growth in post mortem pig traits (crossbred [PI×(DL×DE)] population, n = 207). The experiment integrated miRNA and mRNA expression together with network analysis by using weighted gene co-expression network analysis (WGCNA). In this part, we identified the negative miRNA-mRNA co-expression networks which revealed several biological pathways underlying the difference of meat properties and muscle traits (i.e. glucose metabolic process, mitochondrial ribosome and oxidative phosphorylation).<br /> In the last approach, C2C12 in vitro model studies revealed that miRNAs are modulated in cellular ATP production and energy metabolism processes during myogenic differentiation. Correlation analyses were performed between ATP level, miRNA and mRNA microarray expression profiles during C2C12 differentiation. Among 14 significant miRNAs as representing cellular ATP regulators involved in mitochondrial energy metabolism, miR-423-3p is a novel regulator for cellular ATP/ energy metabolism via targeting the group of mitochondrial energy metabolism genes (<em>Cox6a2, Ndufb7, </em>and<em> Ndufs5</em>).<br /> In conclusion, the present study further adds a comprehensive knowledge on the systems perspective of the skeletal muscle miRNAs and their target genes regulation networks that influence on skeletal muscle starting from early muscle development to mature muscle growth.

<strong>MiRNAs regulieren die Genexpression und modulieren die Entwicklung und den Energiestoffwechsel der Skelettmuskulatur</strong><br /> Das Verständnis von molekularen Netzwerken mit Einfluss auf die biologischen Eigenschaften des Muskels ist notwendig, um die Effizienz der Fleischproduktion und die Fleischqualität in Nutztieren zu verbessern. Die Erforschung von miRNAs stellt einen entscheidenden Durchbruch in der Biologie in den letzten Jahren dar. Die Identifizierung von miRNA-Funktionen wurde seit dem eines der aufstrebenden Forschungsschwerpunkte in der Muskelbiologie mit Bezug auf Muskelentwicklung, -wachstum und -stoffwechsel. Das Ziel dieser Dissertation ist die Identifizierung von miRNAs mit differenzieller Expression in der Skelettmuskulatur im Hinblick auf verschiedene Entwicklungsstadien und Schweinerassen mit unterschiedlichem Muskelansatz. Im Weiteren soll die Verknüpfung von miRNA- und mRNA-Datensätzen helfen, durch miRNA beeinflusste Biofunktionen im Muskel zu benennen. Abschließend sollen exemplarisch einige miRNAs mit Einfluss auf den Muskelmetabolismus durch in vitro Zellkulturstudien validiert werden.<br /> Der erste Forschungsansatz lieferte umfassende miRNA-Expressionsprofile des longissimus dorsi (LD) während der Muskelentwicklung und des Wachstums. Dazu wurden Schweine mit unterschiedlicher phänotypischer Ausprägung unter der Verwendung von spezifisch gefertigten miRNA-Arrays vergleichend analysiert. Tiere der Deutschen Landrasse (DL) und der Rasse Pietrain (Pi) wurden zu zwei wesentlichen pränatalen Entwicklungszeitpunkten (am 63 und 91 Tag nach Empfängnis) sowie im adulten Stadium (180 Tage nach Geburt) untersucht. Für zahlreiche potentielle Kandidaten-miRNAs konnte gezeigt werden, dass diese signifikant hochreguliert sind und Assoziationen zu muskulären Entwicklungsstadien und der Rasse aufzeigten. Zusätzlich wurden porcine Genommikroarrays (Affymetrix GeneChip) verwendet um Profile der differentiell exprimierten mRNA-targets im gleichen Tier zu untersuchen. Durch die Kombination von miRNA- und mRNA-Expressionsdaten gekoppelt mit Ergebnissen aus der Analyse von regulierten Signalwegen (Ingenuity pathway analysis) konnte ein Komplex aus miRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken etabliert werden. Zahlreiche miRNA-mRNA-Interaktionen im Zusammenhang mit Funktionen des zellulären Wachstums, der Proliferation und des Fettstoffwechsels, ermöglichten Einblicke in die Funktion dieser Wechselwirkungen während der Entwicklung und des Wachstums der Skelettmuskulatur. <br /> Der zweite Forschungsansatz berücksichtigt das Muskelwachstum in relevanten post mortem Merkmalen (Kreuzungsrasse [Pi x (DLxDE), n=207). Für diesen Ansatz wurden die Expressionsdaten der miRNA- und mRNA-Analysen in einem Ko-Expressionsnetzwerk integriert. Dabei wurden die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Komponenten berücksichtigt und gewichtet. Negative miRNA-mRNA-Ko-Expressionsnetzwerke konnten identifiziert werden. Diese deuten auf biologisch relevante Signalwegen hin, welche mit unterschiedlichen Ausprägungen der Fleischeigenschaften und Merkmalen der Muskulatur in Zusammenhang stehen (z.B. Prozesse des Glucosemetabolismus, mitochondriale Ribosomen und oxidative Phosphorylierung).<br /> Im abschließenden Forschungsansatz konnte durch Analysen des C2C12-Muskelzellmodells gezeigt werden, dass miRNAs im Zusammenhang mit der zellulären ATP-Produktion und mit Prozessen des Energiemetabolismus im Rahmen der myogenen Differenzierung reguliert werden. Dazu wurden zum Zeitpunkt der C2C12-Zelldifferenzierung ermittelte ATP-Gehalte und miRNA- und mRNA-Mikroarray-Expressionsprofile miteinander verknüpft. Unter den 14 miRNAs, die als zelluläre ATP-Regulatoren am mitochondrialen Energiemetabolismus beteiligt sind, konnte miR-423-3p, durch den Einfluss auf Gene aus der Gruppe des mitochondrialen Energiemetabolismus (<em>Cox6a2, Ndufb7 </em>und<em> Ndufs5</em>), als neuer Regulator für zelluläres ATP bzw. den Energiemetabolismus bestätigt werden.<br /> Zusammenfassend liefern die vorliegenden Studien wesentliche Erkenntnisse zu systemischen Funktionen der miRNAs in der Skelettmuskulatur und verdeutlichen ihren Einfluss auf Gennetzwerke, welche die Prozesse von der frühen Muskelentwicklung bis hin zum Muskelwachstum beeinflussen.