The effect of sulfur deficiency in pea (<em>Pisum sativum</em>) on factors related to nitrogen fixation and on sulfate transporters

Abstract

Sulfur has a vital role in the plant life cycle. S deficiency reduces optimal yield and quality in legumes which lead to a reduction in nutritional value of food and feed. S deficiency also alters the symbiotic interaction between leguminous plants and soil nitrogen fixing bacteria which leads to a decline in N2 fixation rate. An efficient symbiotic nitrogen fixation (SNF) in the nodule demands a strong nutrient exchange between plant and bacterial cells. The plant symbiotic sulfate transporter (SST) supports adequate S supply for full activity of nodules. In the present study, I investigated how different levels of S supply affect the protein and mRNA expression of genes related to N2 fixation in Pisum sativum. Moreover, different sulfate transporter genes were identified in pea and the functional analysis was performed for the symbiotic sulfate transporter from pea after expression in yeast double mutant. Growth retardation was observed in both weak and severe S deficient plants while severe S deficiency led to a significant decline in total biomass and shoot dry weight. Chlorosis and yellowish leaves in severe S deficient plant were observed as a consequence of a 43% decline in the chlorophyll content of young leaves in comparison with the control plants. Both weak and severe S deficiency reduced nodule formation. Thus, nodules appeared smaller and green with less leghemoglobin content in the S deficient groups. Relative transcript abundance of leghemoglobin genes (PsLb5 and PsLb120) did not change significantly under S deficiency conditions in the vegetative phase, thus confirming that expression of both genes is essential to create a low O2 concentration in young nodules. In contrast, severe S deficiency during the generative phase reduced expression of leghemoglobin at mRNA and protein levels. Furthermore, the higher leghemoglobin content in the generative phase is indicative for a higher leghemoglobin demand of mature nodules to maintain a low O2 environment and to protect the nitrogenase for an effective SNF. Nitrogenase is encoded by the nifHDK gene cluster. Severe S deficiency reduced the relative transcript abundance of the β subunits (NifK gene) while expression of α subunits (NifD gene) was mostly unaffected. S deficiency conditions increased relative transcript abundance of ferredoxin to compensate the S limitation in the nodule. Furthermore, a higher level of ferredoxin expression in the generative phase compared to the vegetative phase might be accompanied by a more SNF activity in the generative phase. In contrast to the nodule, relative ferredoxin transcript abundance was reduced under severe S deficiency in the root and leaf tissues supporting sulfite reduction and NADP photo-reduction. Both severe and weak S deficiencies reduced the relative transcript abundance of ferredoxin in the young leaves more than the mature leaves because the mature leaves are the main site of sulfate storage and assimilation. Severe S deficiency reduced expression of the nodule-specific sulfate transporter (SST) in both vegetative and generative phase of plant life which confirms a disruption in sulfate transport in symbiosomes. Phylogenetic analysis of 14-full length sulfate transporter sequences from pea and other known sulfate transporters from the leguminous family revealed that they fall into five major groups. In conclusion, a reduced sulfate import into the nodule probably reduces the sulfate related metabolites and interrupts the expression and biosynthesis of nitrogenase, leghemoglobin and ferredoxin proteins and eventually leads to an interruption of SNF. Moreover, severe S deficiency could limit the S compounds and S containing amino acids essential for the synthesis of critical products such as chlorophyll, thus leading to a lower rate of photosynthesis and fewer energy sources for an efficient yield.

<strong>Der Einfluss von Schwefelmangel bei Erbse (<em>Pisum sativum</em>) auf Faktoren, die in Bezug zur Stickstoff-Fixierung stehen und auf Sulfattransporter</strong><br /> Schwefel spielt eine bedeutende Rolle im Lebenszyklus von Pflanzen. Bei Leguminosen führt S-Mangel nicht nur zu Mindererträgen, sondern er wirkt sich auch negativ auf die Qualität der Samen aus. Des Weiteren resultiert eine suboptimale S-Versorgung in einer Beeinträchtigung der N2-Fixierung. Eine effiziente symbiontische N2-Fixierung (SNF) setzt einen Austausch von Nährstoffen zwischen Pflanzen- und Bakterienzellen voraus. Der Sulfattransporter (SST) trägt zur adäquaten S-Versorgung der Knöllchen bei. In den vorliegenden Untersuchungen wurde überprüft, wie sich eine unterschiedliche S-Versorgung auf die Expression von Genen auswirkt, die in Bezug zur N2-Fixierung von Pisum sativum stehen. Ebenso wurden in Erbsen verschiedene Sulfattransporter-Gene untersucht und funktionelle Analysen für Sulfattransporter nach Expression in Doppelmutanten von Hefe durchgeführt. Bei schwachem und starkem S-Mangel wurden Wachstumsbeeinträchtigungen der Erbse beobachtet. Darüber hinaus resultierte starker S-Mangel in einem signifikanten Rückgang an Gesamt-Biomasse und Spross-Trockenmasse. Im Vergleich zur Kontrolle zeigten Pflanzen mit starkem S-Mangel chlorotische und gelbe Blätter als Folge eines um 43% geringeren Chlorophyllgehalts der jüngeren Blätter. Schwacher und starker Mangel führten zu einer verminderten Knöllchenbildung. Die Knöllchen waren kleiner und grün und enthielten weniger Leghämoglobin. Die relative Transkript-Abundanz von Leghämoglobingenen (PsLb5 und PsLb120) wurde während der vegetativen Phase unter S-Mangelbedingungen nicht signifikant beeinflusst, was bestätigt, dass die Expression beider Gene essentiell ist, um eine niedrige O2-Konzentration in jungen Knöllchen zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu resultierte ein starker S-Mangel während der generativen Phase in einer verminderten Expression von Leghämoglobin im mRNA- und Protein-Level. Weiterhin ist der hohe Leghämoglobingehalt während der generativen Phase ein Indikator für einen hohen Leghämoglobinbedarf reifer Knöllchen, um eine niedrige O2-Umgebung und somit der Nitrogenase optimale Bedingungen für eine effektive SNF zu gewährleisten. Nitrogenase wird durch das nifHDK Gen-Cluster kodiert. Starker S-Mangel reduzierte die relative Transkript-Abundanz der β-Untereinheiten (Nifk Gene), während die Expression der α-Untereinheiten (NifD Gene) meist unbeeinflusst blieb. S-Mangel erhöhte die relative Transkript-Abundanz von Ferredoxin, um die S-Limitierung der Knöllchen zu kompensieren. Eine höhere Ferredoxin-Expression während der generativen Phase im Vergleich zur vegetativen Phase könnte durch eine höhere SNF-Aktivität in der generativen Phase begleitet werden. Im Gegensatz zu den Knöllchen war die relative Ferredoxin-Transkript-Abundanz in den Wurzeln und Blättern bei starkem S-Mangel reduziert. Starker und schwacher S-Mangel führten in jüngeren Blättern zu einer stärkeren Reduktion der relativen Transkript-Abundanz von Ferredoxin im Vergleich zu älteren Blättern, da letztere der Hauptort für die Sulfat-Speicherung und -Assimilation ist. Starker S-Mangel verminderte die Expression des knöllchenspezifischen Sulfattransporters (SST) sowohl während der vegetativen als auch während der generativen Phase, was die Unterbrechung des Sulfattransports in Symbiosome bestätigt. Phylogenetische Analysen von 14 Sulfattransportersequenzen von Erbsen und anderen von Leguminosenfamilien bekannten Sulfattransportern zeigen, dass sie in fünf Hauptgruppen eingeteilt werden können. Es kann geschlussfolgert werden, dass ein verminderter Sulfatimport in die Knöllchen wahrscheinlich die Synthese schwefelabhängiger Metabolite beeinträchtigt und die Expression und Biosynthese von Nitrogenase, Leghämoglobin und Ferredoxin unterbricht und folglich zur Unterbrechung der SNF führt. Des Weiteren kann starker S-Mangel die Bildung S haltiger Verbindungen und S haltiger Aminosäuren beeinträchtigen, die für die Synthese kritischer Produkte wie Chlorophyll erforderlich sind, wodurch die Photosynthese beeinträchtigt wird und somit weniger Energie für die Ertragsbildung zur Verfügung steht.