Subcellular localization of Glutathione peroxidase-like enzymes (GPXLs) in Arabidopsis thaliana and characterization of GPXL3 deficient mutants

Abstract

A common feature of plants being exposed to diverse forms of environmental stress is the increased formation of reactive oxygen species (ROS) in both photosynthesis and respiration. Formation of ROS, however, is not restricted to the electron transport chains (ETC) but also occurs in significant amounts at the plasma membrane via NADPH oxidases, in peroxisomes in the course of multiple metabolic pathways and in the ER during oxidative protein folding. If not detoxified, ROS may directly damage biological molecules such as nucleic acids, amino acids and proteins. The most damaging effect is the onset of autocatalytic lipid peroxidation leading to severe membrane damage. To protect themselves from severe damage, plants evolved multiple detoxification systems for efficient removal of H₂O₂ and phospholipid hydroperoxides. Besides acting as damaging toxins, peroxides are also considered as essential elements of signalling pathways involved in stress sensing and coordinated onset of defence pathways. Detoxification of peroxides occurs via catalase in peroxisomes, via ascorbate peroxidases (APX) and the ascorbate-glutathione (Asa-GSH) cycle in the cytosol, plastids, mitochondria, peroxisomes, via peroxiredoxins (PRXs), and via glutathione-S transferases (GSTs). Another class of proteins involved in peroxide detoxification are glutathione peroxidases (GPXs). Plant GPXs are distinct from animals GPxs as some of the animal GPxs are selenoproteins containing a selenocysteine (Secys) at the catalytic site, whereas the plant GPXs rather possess a cysteine in their catalytic centre. Moreover, the animal Secys-GPxs preferentially use GSH as the reducing substrate while plant GPXs prefer reduced thioredoxin (TRX) as a reductant and show comparatively low activities with GSH. Based on their activity, plant GPX homologues have also been suggested to constitute functional PRXs. To avoid confusion resulting from protein names that are named only on homology and thus strongly suggest a functional link to glutathione, the Arabidopsis GPX family consisting of eight genes for clarity is called GPX-like (GPXL) in this work. <br /> The isoenzyme GPXL3 has been implicated in stress-related H₂O₂ signalling in Arabidopsis and particularly in drought responses. However, results presented in this thesis demonstrate that gpxl3 T-DNA insertion mutants and GPXL3 overexpression lines did not display any obvious phenotype under mannitol or drought stress conditions. Determination of localization of GPXLs is essential for understanding their physiological function in the detoxification of H₂O₂ or lipid hydroperoxides. There are various predictions for the localization of this gene family, but the precise subcellular location of most GPXL proteins in Arabidopsis was still unknown at the beginning of this work. Using confocal laser scanning microscopy (CLSM), the intracellular distribution patterns of roGFP2-tagged GPXL proteins were examined in two different expression systems via transient and stable transformation methods. In order to study the localization of each GPXL, C- and N-terminal fusions of most of the isoforms were generated and analysed by CLSM. Our findings validate that GPXL1 and GPXL7 are targeted to plastids, and that GPXL2 and GPXL8 are cytosolic/nuclear proteins. The results also show novel unexpected localizations for GPXL3 in the secretory pathway, predominantly the Golgi, and for GPXL4 and GPXL5 being specifically anchored to the plasma membrane. These findings substantiate and complement current knowledge on the localization of GPXLs in Arabidopsis. The novel information may help to better understand the role of GPXLs in crops and ultimately exploit their features in breeding of more stress-resistant plants.

Ein gemeinsames Merkmal von Pflanzen, die verschiedenen Formen von Umweltbelastungen ausgesetzt sind, ist die verstärkte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowohl bei der Photosynthese als auch bei der Atmung. Bildung von ROS ist jedoch nicht auf die Elektronentransportketten beschränkt (ETC), sondern tritt auch in erheblichen Mengen an der Plasmamembran über NADPH Oxidasen, in den Peroxisomen im Verlauf mehrerer Stoffwechselwege und im ER während oxidative Proteinfaltung auf. Wenn nicht entgiftet, können ROS biologische Moleküle wie Nukleinsäuren, Aminosäuren und Proteine direkt schädigen. Die schädlichste Wirkung ist der Beginn der autokatalytischen Lipidperoxidation, die zu einer schweren Membranschädigung führt. Um sich vor schweren Schädigungen zu schützen, entwickelten sich mehrere Entgiftungssysteme zur effizienten Entfernung von H₂O₂ und Phospholipid-Hydroperoxiden. Neben der Wirkung als schädlich Toxine, werden Peroxide auch als wesentliche Elemente von Signalwegen in Stressreaktionen und dem koordinierte Auftreten von Abwehrmechanismen beteiligt betrachtet. Entgiftung von Peroxiden erfolgt mittels Katalase in Peroxisomen, über Ascorbat Peroxidasen (APX) und den Ascorbat-Glutathion (Asa-GSH) Zyklus im Cytosol, in Plastiden, in Mitochondrien und Peroxisomen, via Peroxiredoxinen (PRXs) und über Glutathion-S-Transferasen (GSTs). Eine weitere Klasse von Proteinen, die an der Peroxidentgiftung beteiligt sind, sind Glutathionperoxidasen (GPXs). Pflanzliche GPXen unterscheiden sich von tierischen GPXen dadurch, dass einige der tierischen GPXen Selenoproteine sind und ein Selenocystein (SeCys) an der katalytischen Stelle enthalten, während die pflanzlichen GPXen auschließlich Cystein in ihrem katalytischen Zentrum besitzen. Darüber hinaus verwenden die tierischen Secys-GPx bevorzugt GSH als reduzierendes Substrat, während pflanzliche GPX das reduzierte Thioredoxin (TRX) als Reduktionsmittel bevorzugen und vergleichsweise geringe Aktivitäten mit GSH zeigen. Basierend auf ihrer Aktivität wurde auch vorgeschlagen, dass Pflanzen-GPX eine separate Gruppe funktioneller PRX-Homologe darstellen. Um Verwechslungen von Proteinnamen, die nur auf Sequenzhomologie beruht und somit stark eine funktionelle Verbindung zu Glutathion vorschlagen, zu vermeiden, werden acht Isoformen der GPX Familie in Arabidopsis in dieser Arbeit als GPX-like (GPXL) bezeichnet.<br /> Das Isoenzym GPXL3 wurde in der Vergangenheit als Schlüsselenzym in der stressbedingten H₂O₂-Signalisierung in Arabidopsis insbesondere bei Dürre-Reaktionen beschrieben. In dieser Arbeit werden nun jedoch ergebnisse vorgestellt, die zeigen, dass gpxl3 T-DNA Insertions mutanten und GPXL3 Überexpressionslinien keinen offensichtlichen Phänotyp unter Mannit oder Dürrestressbedingungen aufweisen. Die Bestimmung der Lokalisation von GPXLs ist für das Verständnis ihrer physiologischen Funktion bei der Entgiftung von H₂O₂ oder Lipidhydroperoxiden wesentlich. Es gibt verschiedene Vorhersagen für die Lokalisierung der Proteine dieser Genfamilie, aber die genaue subzelluläre Lage der meisten GPXL-Proteine in Arabidopsis war zu Beginn dieser Arbeit noch unbekannt. Unter Verwendung der konfokalen Laserscanningmikroskopie (CLSM) wurden die intrazellulären Verteilungsmuster von mit roGFP markierten GPXL-Proteinen in zwei unterschiedlichen Expressionssystemen über transiente und stabile Transformationsverfahren untersucht. Um die Lokalisation von jedem GPXL zu untersuchen, wurden C- und N-terminale Fusionen der meisten Isoformen erzeugt und durch CLSM analysiert. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass GPXL1 und GPXL7 auf Plastiden gerichtet sind und dass GPXL2 und GPXL8 cytosolische/nukleäre Proteine sind. Die Ergebnisse zeigen auch unerwartete neue Lokalisierungen für GPXL3 im Sekretorischen Weg, überwiegend dem Golgi und für GPXL4 und GPXL5 spezifisch an der Plasmamembran. Diese Ergebnisse bestätigen und ergänzen das derzeitige Wissen über die Lokalisierung von GPXLs in Arabidopsis. Die neue Information kann helfen, die Rolle von GPXLs in Kulturen besser zu verstehen und letztlich ihre Eigenschaften bei der Züchtung von stressresistenten Nutzpflanzen zu nutzen.