The role of cellular and extracellular MicroRNAs in bovine follicular development and as potential indicators of early pregnancy

Abstract

MicroRNAs (miRNAs), a class of short non-coding RNA molecules, emerged as major regulators of ~60% of all protein encoding genes. These molecules play an important role in mammalian follicular growth and embryonic development by modulating the expression of genes in follicular somatic cells and early embryos at post-transcriptional level. In addition to these cellular miRNAs, extracellular miRNAs found in virtually all biological fluids are getting great attention as potential diagnostic markers for diseases and various physiological conditions. The present study was designed to characterize the expression profile and functional role of cellular miRNAs in bovine granulosa cells and assessing the potential use of extracellular miRNAs in bovine early pregnancy diagnosis. For this, three experiments were conducted. <br /> In order to characterize specific miRNAs expression patterns, next-generation sequencing analysis in granulosa cells of preovulatory dominant and subordinate follicles obtained at day 19 of the estrous cycle revealed a total of 315 and 323 known miRNAs to be expressed, respectively. Among these, 64 miRNAs were found to be differentially expressed, of which 34 miRNAs including the miR-183-96-182 cluster were preferentially enriched, while the remaining 30 miRNAs were suppressed in preovulatory dominant follicles compared to the subordinate follicles counterpart. Moreover, the negative correlation in the expression patterns of the miR-183-96-182 cluster and its validated pro-apoptotic target gene, FOXO1 in preovulatory dominant follicles further substantiates the regulatory role of miRNAs in ovarian function during the follicular phase of the bovine estrous cycle. <br /> Functional analysis of the miR-183-96-182 cluster miRNAs in cultured granulosa cells showed that enrichment or inhibition of this miRNA cluster resulted in suppression or increased FOXO1 mRNA and protein, respectively. Concomitantly, overexpression of the miRNA cluster increased the rate of cell proliferation, decreased the proportion of cells under the G0/G1 arrest and increased the percentage of cells under the S phase. Even though inhibition of the miR-183-96-182 cluster slowed down the rate of cell proliferation, no measurable changes in the cell cycle status were observed. Furthermore, selective knockdown of FOXO1 mRNA using siRNA showed similar phenotypes as observed in the overexpression of the miRNA cluster experiment. <br /> In the third experiment, miRNA PCR array platform was used to determine the expression signature of extracellular miRNAs in serum samples from pregnant and non-pregnant cows at day 19 and 24 post-insemination. Results showed that a total of 302 and 316 miRNAs were detected in day 19 pregnant and non-pregnant cows, respectively. Similarly, 356 and 325 miRNAs were detected in day 24 pregnant and non-pregnant cows, respectively. Comparative expression analysis revealed 8 and 23 differentially expressed miRNAs in day 19 and 24 pregnant cows, respectively. Interestingly, 1 miRNA (miR-433) and 4 miRNAs (miR-487b, miR-495-3p, miR-376b-3p, and miR-323a-3p) homologous to the human pregnancy-associated C14MC miRNA cluster were among the differentially expressed miRNAs in day 19 and 24 pregnant cows, respectively. The predicted target genes of the differentially expressed extracellular miRNAs were found to be involved in pathways important in pregnancy implantation like the adherens junction and ECM-interaction. <br /> Taken all together, the present study demonstrates the functional involvement of miRNAs in the later stage of bovine follicular development by coordinately targeting key genes essential in determining the follicular fate. Moreover, this study characterizes unique expression signatures of extracellular miRNAs that could be potential indicators of early pregnancy in dairy cows.

<strong>Die Rolle der zellulären und extrazellulären MicroRNAs in der Rinderfollikelentwicklung und als mögliche Indikatoren einer frühen Trächtigkeit</strong><br /> MicroRNAs (miRNAs), eine Klasse von kurzen nicht-kodierenden RNA-Molekülen, gelten als Hauptregulatoren von ~60% aller Protein-kodierenden Gene. Diese Moleküle spielen eine wichtige Rolle beim Follikelwachstum und der embryonalen Entwicklung von Säugetieren, indem sie die Expression von Genen in follikulären somatischen Zellen und frühen Embryonen auf der posttranskriptionellen Ebene modulieren. Zusätzlich zu diesen zellulären miRNAs haben extrazelluläre miRNAs, die in praktisch allen biologischen Flüssigkeiten gefunden werden, als potentielle diagnostische Marker für Krankheiten und verschiedene physiologische Zustände große Aufmerksamkeit erlangt. In der vorliegenden Studie wurden dazu Expressionsprofile und die funktionelle Rolle dieser zellulären miRNAs in Rinder-Granulosazellen charakterisiert und der mögliche Einsatz von extrazellulären miRNAs in der Rinder-Frühträchtigkeitsdiagnose beurteilt. Dazu wurden drei Experimente durchgeführt.<br /> Zur Charakterisierung der miRNA-Expressionsmuster konnten mittels einer „Next-Generation Sequenzanalyse“ in Granulosazellen von präovulatorisch dominanten und subordinierten Follikeln vom Tag 19 des Östruszyklus insgesamt 315 bzw. 323 bekannte miRNAs identifiziert werden. Von diesen waren 64 miRNAs differentiell exprimiert, davon zeigten 34 miRNAs einschließlich des miR-183-96-182-Clusters eine Hochregulation, während die restlichen 30 miRNAs in präovulatorischen dominanten Follikeln im Vergleich zum subordinierten Follikel runterreguliert waren. Darüber hinaus bestätigt die negative Korrelation in den Expressionsmustern des miR-183-96-182-Clusters und seines validierten pro-apoptotischen Zielgens FOXO1 in präovulatorisch dominanten Follikeln die regulatorische Rolle von miRNAs während der follikulären Phase des Östruszyklus des Rindes.<br /> Die funktionelle Analyse der miR-183-96-182-Cluster-miRNAs in kultivierten Granulosazellen zeigte, dass die Hoch- oder Runterregulation dieses miRNA-Clusters zu einer Suppression bzw. Erhöhung der Expression von FOXO1-mRNA bzw. Protein führte. Gleichzeitig erhöhte die Überexpression des miRNA-Clusters die Zellproliferationsrate, verringerte den Anteil der Zellen während dem G0/G1-Zellzyklusarrest und erhöhte den Prozentsatz der Zellen während der S-Phase. Obwohl die Hemmung der Expression des miR-183-96-182-Clusters die Geschwindigkeit der Zellproliferation verlangsamte, wurden keine messbaren Veränderungen im Zellzyklusstatus beobachtet. Der selektive Knockdown von FOXO1 unter Verwendung von siRNA zeigte ähnliche Phänotypen, wie sie bei der Überexpression des miRNA-Cluster-Experiments beobachtet wurden.<br /> Im dritten Experiment wurde eine miRNA PCR-Array-Plattform verwendet, um die Expressions-Signatur von extrazellulären miRNAs in Serumproben von trächtigen und nicht-trächtigen Kühen am Tag 19 und 24 nach der Insemination zu erstellen. Es konnten in Proben vom Tag 19 insgesamt 302 und 316 miRNAs nachgewiesen wurden. ?Am Tag 24 wurden 356 und 325 miRNAs identifiziert. Die Vergleichs-Expressionsanalyse ergab 8 sowie 23 differentiell exprimierte miRNAs am Tag 19 bzw. 24 bei trächtigen Kühen. Interessanterweise waren eine miRNA (miR-433) und 4 miRNAs (miR-487b, miR-495-3p, miR-376b-3p und miR-323a-3p) homolog zu dem humanen schwangerschafts-assoziierten C14MC-miRNA-Cluster exprimiert. Es wurde festgestellt, dass die vorhergesagten Zielgene der differentiell exprimierten extrazellulären miRNAs an Signalwegen beteiligt sind, die für die Trächtigkeitsimplantation, wie die Adhärens-Junction und die ECM-Interaktion, wichtig sind.<br /> Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie die funktionelle Beteiligung von miRNAs im späteren Stadium der Entwicklung der Rinderfollikel durch koordinierte Ansteuerung von wichtigen Genen, die für die Bestimmung der follikulären Entwicklung wesentlich sind. Diese Studie zeigt einzigartige Expressionssignaturen von extrazellulären miRNAs, die potentielle Indikatoren für die frühe Trächtigkeit bei Milchkühen sein könnten.