Epigenetic and exosome-mediated cell-cell communication in follicular cells and preimplantation embryos

Abstract

Follicular cells and preimplantation embryos communication with their in vivo or in vitro environments via mechanisms including cell adhesion and extracellular vesicles is crucially essential for normal oocyte and embryo development and subsequently successful pregnancy. Therefore, this dissertation aims to assess the potential role of exosomes in granulosa cells’ oxidative stress response and figure out the epigenetic role of DNA methylation in the regulation of focal adhesion pathway in preimplantation embryos. For that, two main experiments were conducted; where bovine granulosa cells were cultured under oxidative stress conditions induced by H₂O₂. Exosomes were isolated from culture media and subjected to mRNA quantification analysis. Thereafter, control and H₂O₂-stressed cells were co-cultured with non-stress or stress-released exosomes. Cells of all experimental groups were subjected to ROS level, mitochondrial activity, cell cycle and cell proliferation assays as well as mRNA and protein expression analyses. In parallel, bovine embryos were cultured in media supplemented with EGF and/or HA. Blastocysts were subjected to ROS level, TUNEL, cryopreservation assays and protein analysis. Moreover, embryos were cultured in media supplemented with epidermal growth factor (EGF) and hyaluronic acid (HA) pre, post and during embryonic genome activation (EGA). Blastocysts from all groups were subjected to mRNA expression and DNA methylation analysis of genes involved in focal adhesion pathway. Results revealed that, H₂O₂-induced oxidative stress significantly increased ROS level as well as mRNA and protein expression of Nrf2 and antioxidant genes. Stress-released exosomes were enriched with mRNA of Nrf2 and selective antioxidants (CAT, and TXN1). Granulosa cells co-cultured with stress-released exosomes exhibited higher mRNA and protein levels of Nrf2 and its downstream antioxidants which in turn reduced ROS level and enhanced mitochondrial activity and cell proliferation under oxidative stress conditions. Furthermore, culture media supplemented with EGF and/or HA altered the DNA methylation pattern of genes involved in focal adhesion pathway associated with significant high mRNA and protein levels. The supplementation of EGF and HA particularly during EGA had a positive effect on mRNA expression of focal adhesion genes. Blastocysts with higher focal adhesion mRNA and protein levels had low ROS level and apoptosis with high cryotolerance. These findings highlighted the role of exosomes and DNA methylation in cell-cell communications and subsequently cell function and embryo quality under suboptimal conditions.

<strong>Epigenetische und exosomal-vermittelte Kommunikation von Follikelzellen und präimplantierten Embryonen</strong><br /> Die Kommunikation von Follikelzellen und präimplantativen Embryonen mit ihren <em>in vivo</em> oder <em>in vitro</em> Umgebungen erfolgt über Mechanismen wie z. B. Zelladhäsion und extrazelluläre Vesikel. Diese sind ausschlaggebend für eine normale Entwicklung der Eizelle, des Embryos sowie eine anschließende erfolgreiche Trächtigkeit. Daher ist das Ziel der vorliegende Dissertation, die Bedeutung von Exosomen in der oxidativen Stressantwort von Granulosazellen zu untersuchen. Zusätzlich soll die epigenetische Funktion der DNA-Methylierung auf die Regulierung der fokalen Adhäsion in der Präimplantation von Embryonen betrachtet werden. Dazu wurden zwei Experimente durchgeführt, in welchen bovine Granulosazellen unter oxidativen Stressbedingungen mittels H₂O₂ kultiviert wurden. Die Exosomen wurden aus den Kulturmedien isoliert und deren mRNA quantifiziert. Anschließend wurden die Zellen der Kontroll- sowie der H₂O₂-behandelten Gruppe mit Exosomen co-kultiviert, die entweder unter der H₂O₂-Behandlung oder ohne diese gebilded wurden. Aus allen experimentellen Gruppen wurden Zellen hinsichtlich ihres ROS-Niveaus, ihrer mitochondrialen Aktivität, ihres Zellzyklus und der Zellproliferation untersucht sowie die Expression von mRNA und Proteinen bestimmt. Zeitgleich wurden bovine Embryonen in Medien kultiviert, die mit mit EGF und/oder HA angereichert wurden. Blastozysten wurden hinsichtlich des ROS-Niveaus, TUNEL, der Kryokonservierung und der Proteinexpression analysiert. Darüber hinaus wurden Embryonen vor, nach und während der Embryonale Genomaktivierung (EGA) in einem Medium kultiviert das mit Epidermaler Wachstums Faktor (EGF) und Hyalurinsäuer (HA) angereichert wurde. Blastozysten aller Untersuchungsgruppen wurden hinsichtlich ihrer mRNA-Expression und DNA-Methylierung von Genen, die in den Verlauf der Fokalhadhäsion involviert sind, analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass der durch H₂O₂ induzierte oxidative Stress die ROS-Niveaus, die mRNA- und Protein-Expression von Nrf2 und antioxidativen Genen signifikant gesteigert hat. Unter Belastung ausgeschüttete Exosomen waren mit mRNA von Nrf2 und selektiven Antioxidantien (CAT und TXN1) angereichert. Granulosazellen, die mit unter Stress freigesetzten Exosomen co-kultiviert wurden, wiesen höhere mRNA und Proteinkonzentrationen von Nrf2 sowie dessen nachfolgenden Antioxidantien auf. Diese reduzierten wiederum das ROS-Niveau, verstärkten die mitochondriale Aktivität und Zellproliferation unter oxidativem Stress. Weiterhin veränderte die mit EGF und/oder HA angereicherten Medien das Muster der DNA-Methylierung von Genen, die in den Verlauf der fokalen Adhäsion involviert sind und führte zu einer signifikant erhöhten mRNA- und Proteinexpression dieser Gene. Vor allem die Ergänzug von EGF und HA während der EGA zeigte einen positvien Effekt auf die mRNA Expression der Gene der fokalen Adhäsion. Blastozysten mit erhöhten mRNA und Proteinlevels von Genen der fokalen Adhäsion zeigten niedrigere ROS-Niveaus und Zelltod bei hoher Kryotoleranz. Diese Ergebnisse betonen die Rolle von Exosomen und der DNA-Methylierung in der Kommunikation zwischen Zellen, der anschließenden Zellfunktion und der Embryoqualität unter suboptimalen Bedingungen