Exploring ethylenediurea (EDU) as an ozone biomonitoring and screening tool for rice (<em>Oryza sativa</em> L.)

Abstract

Tropospheric ozone concentrations are rapidly rising in many developing parts of the world, thereby threatening food security. Therefore, breeding for adapting rice varieties is essential in Asia, especially in the Indian subcontinent, to cope with ozone stress and to secure staple food supply. Genotypic variation can play a key role in successful ozone tolerance/resistance breeding. However, ozone impact evaluation on crops and field screening experiments in these highly ozone affected areas are scarce, as the establishment of field-based ozone fumigation facilities can be technically challenging or very expensive. Alternatively, ethylenediurea (EDU) has been proposed as a chemical applied as a foliar spray to assess the effects of ozone in large-scale field experiments. However, little has been known about its confounding effects on rice in the absence of ozone, and the protection mechanisms against ozone phytotoxic effects. Therefore, a series of agronomic and physiological experiments were performed including transcriptomics (RNA-Seq) and scanning electron microscopy (SEM), to test the suitability and feasibility of EDU as a future ozone biomonitoring tool for field crops. Four different treatments, (i) control (below the damage threshold level, 40 ppb), (ii) control+EDU, (iii) ozone (average 77 to 108 ppb for 7 h day-1), and ozone+EDU were assigned to rice genotypes ranked a priori in terms of ozone tolerance. Application of EDU did not affect plants in the absence of ozone, but it alleviated negative effects of ozone on plant morphology, leaf symptom formation, spectral reflectance indices such as the normalized difference vegetation index (NDVI), SPAD value, lipid peroxidation, photosynthetic parameters, panicle number, spikelet sterility as well as biomass and grain yields in the sensitive genotypes. RNA-sequencing and SEM were conducted using the Bangladeshi high yielding rice variety BR28 which was highly affected by ozone (37 percent grain yield reductions) and showed consistent recovery by EDU applications. Transcriptome profiling revealed that several thousand genes responded to ozone treatment, but almost none responded to EDU application. The dominant trend of significant interactions between ozone treatment and EDU application for the ozone responsive genes was the ozone mediated up-regulation mitigated by EDU application. These transcriptional patterns suggested that EDU did not enhance stress defense pathways in plants, but rather acted as a surface protectant against upstream physiological stress reactions. Additional experiments indicated that EDU might have ozone degrading properties due to abiotic chemical interactions between ozone and EDU. Further, SEM image analyses displayed the presence of EDU deposits on treated leaf surfaces. We further demonstrated that EDU application did not alleviate the reaction of plants to a number of other abiotic stresses i.e. iron toxicity, zinc deficiency and salinity. In conclusion, EDU is a surface protectant that specifically mitigates ozone stress without interfering with the plants' stress response systems. These properties, together with its ease of application, make it very suitable for biomonitoring and screening studies of ozone damage to field crops in developing countries.

Die troposphärischen Ozonkonzentrationen steigen in vielen Entwicklungsländern rapide an und bedrohen damit die Ernährungssicherheit. Deshalb ist die Züchtung zur Anpassung von Reissorten in Asien, insbesondere auf dem indischen Subkontinent, unerlässlich, um dem Ozonstress zu begegnen und die Versorgung mit Grundnahrungsmitteln zu sichern. Genotypische Variationen können eine Schlüsselrolle für eine erfolgreiche Ozonverträglichkeits-/Widerstandszüchtung spielen. Allerdings sind Bewertung der Ozonauswirkungen auf Pflanzen und Screening-Experimente in diesen stark ozonbelasteten Gebieten selten, da der Aufbau von feldbasierten Ozonbegasungsanlagen technisch anspruchsvoll oder sehr teuer sein kann. Alternativ wurde Ethylendiurea (EDU) als Chemikalie vorgeschlagen, die als Blattspray eingesetzt wird, um die Auswirkungen von Ozon in groß angelegten Feldversuchen zu beurteilen. Über seine Wirkung auf Reis in Abwesenheit von Ozon und die Schutzmechanismen gegen phytotoxische Wirkungen von Ozon ist jedoch wenig bekannt. Daher wurden eine Reihe von agronomischen und physiologischen Experimenten durchgeführt, darunter transkriptomische Analytik (RNA-Seq) und Rasterelektronenmikroskopie (REM), um die Eignung von EDU als zukünftiges Ozon- Biomonitoring-Tool für Feldkulturen zu testen. Vier verschiedene Behandlungen, (i) Kontrolle (unterhalb der Schadschwelle, 40 ppb), (ii) Kontrolle+EDU, (iii) Ozon (durchschnittlich 77 bis 108 ppb für 7 h pro Tag) und Ozon+EDU wurden bei Reisgenotypen getestet, die in Bezug auf die Ozonverträglichkeit a priori eingestuft wurden. Die Anwendung von EDU wirkte sich in Abwesenheit von Ozon nicht auf Pflanzen aus, aber sie milderte negative Auswirkungen von Ozon auf die Pflanzenmorphologie, die Bildung von Blattsymptomen, spektrale Reflexionsindizes wie den normierten differenzierten Vegetationsindex (NDVI), den SPAD-Wert, die Lipidperoxidation, photosynthetische Parameter, die Rispenzahl, die Sterilität der Ährchen, sowie die Biomasse- und Getreideerträge in den empfindlichen Genotypen. Die RNA-Sequenzierung und die REM wurden mit der bangladeschischen Hochertragsreissorte BR28 durchgeführt, die stark von Ozon betroffen war (37 Prozent Ertragsminderung) und eine fortlaufende Regenerieung durch die EDUAnwendungen zeigte. Die Transkriptomprofilierung ergab, dass mehrere tausend Gene auf die Ozonbehandlung ansprachen, aber fast keines reagierte auf die EDUAnwendung. Der Trend, welcher sich bei der signifikanten Wechselwirkung zwischen der Ozonbehandlung und der EDU-Anwendung abzeichnete, erfolgte auf Grund einer durch Ozon induzierten Hochregulierung der auf Ozon reagierenden Gene, welche durch die EDU-Anwendung abgeschwächt wurde. Diese Transkriptionsmuster deuteten darauf hin, dass EDU die Stoffwechselwege der Stressabwehr in den getesteten Pflanzen nicht direkt beeinflusst, sondern als Oberflächenschutz gegen physiologische Stressreaktionen wirkt. Zusätzliche Experimente zeigten, dass EDU aufgrund von abiotisch-chemischer Wechselwirkungen zwischen Ozon und EDU ozonabbauende Eigenschaften aufweisen könnte. Darüber hinaus zeigten REMBildanalysen das Vorhandensein von EDU-Ablagerungen auf behandelten Blattoberflächen. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die EDU-Anwendung die Reaktion der Pflanzen auf eine Reihe anderer abiotischer Stresse wie Eisentoxizität, Zinkmangel und Salzstress nicht verringert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EDU ein Oberflächenschutzmittel ist, das gezielt den Ozonstress mildert, ohne die Stressreaktionssysteme der Pflanzen direkt zu beeinflussen. Diese Eigenschaften und die einfache Anwendung, sorgen dafür, dass EDU für Biomonitoring und Screening-Studien von Ozonschäden an Feldkulturen in Entwicklungsländern sehr gut geeignet ist.