Selektion von DNA-Aptameren gegen aktiviertes Protein C, aktivierten Gerinnungsfaktor XI und Plasmin mittels Kapillarelektrophorese-SELEX

Abstract

Aptamere sind einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, welche durch die Ausbildung einer Tertiärstruktur mit hoher Spezifität und Affinität an die Oberfläche von Proteinen binden. Diese Eigenschaft lässt Aptamere unter anderem als eine viel versprechende Grundlage für die Entwicklung Aptamer-basierter Testsysteme (OECA) von Enzymaktivität fungieren. Die Selektion von Aptameren gegen ein bestimmtes Zielenzym wird mit dem sog. SELEX-Verfahren erreicht. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die bisher am Institut noch verhältnismäßig neue Methode der Kapillarelektrophorese-SELEX (CE-SELEX) zu optimieren sowie das Potential der Methode auszuloten. Die Methode sollte mittels Aptamer-Selektion gegen APC etabliert werden. Darüber hinaus sollten im optimalen Falle zwei weitere Aptamere sowohl gegen aktivierten Faktor XI (FXIa) als auch gegen Plasmin identifiziert werden, um hiermit die Entwicklung von entsprechenden OECA voran zu treiben.<br /> Im Allgemeinen bestätigte sich einer der in der Literatur beschriebenen Vorteile der Aptamer-Selektion mittels Kapillarelektrophorese. So gelang es uns bereits nach fünf Zyklen, mit NB-1 ein potentes und hochspezifisches Aptamer gegen APC zu selektieren. Dieses zeigte in weiteren Charakterisierungsversuchen ein nahezu identisches Sequenzmotiv zu dem bereits existierenden APC-Aptamer HS02-52G und zudem eine höchstwahrscheinlich identische Bindungsstelle auf der Enzymoberfläche. Im Gegensatz hierzu entpuppten sich die Experimente zur Selektion gegen Faktor XIa und Plasmin aus mehreren potentiellen Gründen als nicht erfolgreich und es zeigte sich abschließend dementsprechend keine Bindung der selektierten ssDNA an das entsprechende Zielenzym. Die möglichen Ursachen hierfür wurden ausgiebig beleuchtet. Trotzdem festigte sich die Theorie, dass die Struktur des Zielenzyms augenscheinlich den entscheidenden Einfluss auf den Erfolg oder Misserfolg einer Aptamer-Selektion auszuüben scheint und hiermit dem Potential der gesamten Methode natürliche Grenzen gesetzt sind.