Axodendritische Verteilung der Isoformen von Tau in primären neuronalen Zellkulturmodellen der Demenz

Abstract

Tau ist ein neuronales Protein, welches in kausalen Zusammenhang mit der Alzheimer Demenzerkrankung (AD), der Frontotemporalen Demenz (FTD), und anderen Tauopathien gebracht wird. Als Mikrotubuli-Assoziertes Protein (MAP) ist Tau vorwiegend in axonalen Fortsätzen von Neuronen lokalisiert. Im pathologischen Verlauf der AD wird Tau aber auch in die dendritischen Fortsätze von Neuronen umverteilt. Die polare Verteilung von Tau wird somit aufgehoben. Tau kommt im Zentralen Nervensystem von Erwachsenen in 6 Isoformen vor, die sich durch die An- oder Abwesenheit von 2 N-terminalen Einschüben (N) oder der 2. (von insgesamt 4) Repeat-Einheit (R) unterscheiden. Der Einfluss dieser 6 Isoformen von Tau auf den Prozess der pathologischen Fehlverteilung ist nicht bekannt.<br /> In dieser Arbeit wurde daher die physiologische und die pathologische Verteilung der unterschiedlichen Tau-Isoformen untersucht. Als Modell wurde ein definiertes Modell der neuronalen Zellpolarität, primäre Nagetiervorderhirnneurone, verwendet.<br /> Primäre Neurone sind ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung von Tau im Kontext der neuronalen Entwicklung, sowie für die Untersuchung neuronaler Krankheitsprozesse. Primäre Neuronen zu kultivieren ist jedoch aufwendig und erfordert meist die Verwendung von kostenintensiven und patent-geschützten Zellkulturmedien unbekannter Zusammensetzung. Im ersten Kapitel wird daher eine kostengünstige und simplifizierte Prozedur zum Kultivieren von primären Neuronen beschrieben, basierend auf einer mittlerweile kommerziell erhältlichen Variante eines neuronalen Zellkultursupplement (NS21) mit bekannter Zusammensetzung. Weiterhin werden Techniken für die Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung beschrieben, die für die Untersuchung der Verteilung von Tau in primären Neuronen notwendig sind.<br /> Primäre Neurone sind mit nicht-viralen Vektoren schwierig zu transfizieren und empfind-lich gegenüber zytoskelettalen Manipulationen und Lebend-Zell-Beobachtung, insbeson-dere nach mehrwöchiger Kultivierung. In einem zweiten Kapitel wird daher eine einfache nicht-virale Transfektionsmethode beschrieben, die es ermöglicht Tau in allen neuronalen Entwicklungsstufen in ähnlich niedrigen Mengen wie endogenes Tau zu exprimieren.<br /> Mithilfe der o. g. Methoden, insbesondere Transfektion der unterschiedlichen Tau-Isoformen des Menschen und der Maus in primären Neuronen, wurde schließlich in einem dritten Kapitel das axodendritische Verteilungsmuster von Tau untersucht. Es zeigte sich, dass die Tau Diffusionsbarriere (TDB), lokalisiert inmitten des Axon-Initialen-Segments (AIS), sowohl die retrograde als auch die anterograde Ausbreitung von Tau kontrolliert. Während die Tau-Isoformen ohne N-terminale Inserts effizient in das Axon geleitet werden, verbleibt die längste Tau-Isoform (2N4R-Tau) teilweise im Zellsoma und Dendriten, wo sie das Wachstum von Dendriten und dendritischen Dornen beschleunigt.<br /> Die TDB (lokalisiert im AIS) wurde durch Knockdown von AIS-Komponenten (ankyrin G, EB1), oder Überexpression einer AD-assozierten Kinase, Glykogen-Synthase-Kinase-3-beta (GSK3beta), gestört. Mithilfe von hochauflösender Nanoskopie und Lebendzellbeobachtung konnte gezeigt werden, dass die Mikrotubuli im AIS sehr dynamisch sind, eine axonale Besonderheit essentiell für die Funktion der TDB. Pathomechanistische Veränderungen im AIS nach Exposition mit Amyloid-beta (der AD-auslösende Faktor) waren Aktivierung von Cofilin und f-Aktin Umstrukturierung (beides wichtige Regulatoren des Aktin basierten Zytoskeletts), sowie eine reduzierte Dynamik des Mikrotubuli-Zellskelettsystems. Gleichzeitig brach die AIS/TDB Verteilungsfunktion zusammen, was zu AD-ähnlicher Fehlverteilung von Tau führte.<br /> Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit Methoden für die Kultivierung und Transfektion von primären Neuronen entwickelt, mittels welcher dann gezeigt wurde, dass die unterschiedlichen Tau Isoformen von Mensch und Maus sich sowohl untereinander, als auch in AD-ähnlichem Stress im axodendritischen Verteilungsmuster unterscheiden. Die Tau-Isoformen beschleunigen in unterschiedlichem Ausmaß das Dendriten- und dendritisches Dornenwachstum. Weiterhin hängt die differenzielle axodendritische Verteilung der Tau Isoformen von der Integrität der TDB und des AIS ab. Zukünftige Forschung wird die spezielle Verteilung und die dendritischen Effekte insbesondere von 2N4R-Tau, welches derzeit bevorzugt für Mausmodelle eingesetzt wird, in Betracht ziehen müssen.

<strong>Tau isoforms show differential axodendritic distributions in primary neuronal cell culture models of dementia</strong><br /> The protein Tau is a neuronal protein associated with Alzheimer Disease (AD), Frontotemporal Dementia (FTD) and many other neurological diseases summarized as Tauopathies. Tau is a Microtubule Associated Protein (MAP) present predominantly in axons, but becomes mislocalized in pathological settings. In the human central nervous system (CNS), Tau exists in 6 splice variants, differentiated by the presence or absence of the second of four repeats or of 2 N-terminal inserts. The contribution of these Tau isoforms to axodendritic mislocalization in neuropsychiatric disease is understudied.<br /> Here we investigate the physiological sorting and pathological missorting of the different isoforms of Tau in primary rodent forebrain neurons. This cell model is an established model of neuronal cell polarity.<br /> Primary neurons have proven to be an invaluable tool for the investigation of Tau and neuronal cell polarity in the context of neuronal development and neurodegeneration. Culturing neurons, however, is time consuming and requires multiple feeding steps and media exchanges, and either the use of proprietary media supplements or tedious preparation of complex media. In a first step we describe and define a relatively cheap and easy cell culture procedure based on a commercially available neuronal culture supplement with 21 ingredents (NS21) of known composition, as well as basic fixation techniques. <br /> Also, mature primary neurons are notoriously difficult to transfect with nonviral vectors and are very sensitive both to cytoskeletal manipulation and to imaging. Thus, in a second step, we developed and described a simple nonviral transfection method enabling transfection of Tau to achieve expression levels comparable to endogenous Tau. <br /> Finally, using the above described methods such as expression of different isoforms of human and mouse Tau in primary neurons, we investigated the sorting behavior of Tau. We found that the Tau diffusion barrier (TDB), located within the axon initial segment (AIS), controls not only retrograde but also anterograde traffic of Tau. Tau isoforms without the N-terminal inserts were sorted efficiently into the axon. However, the longest isoform (2N4R-Tau) was partially retained in cell bodies and dendrites, where it accelerated spine and dendrite growth. The TDB was impaired when AIS components (ankyrin G, EB1) were knocked down or when glycogen synthase kinase-3-beta (GSK3beta; an AD-associated kinase tethered to the AIS) was overexpressed. Using superresolution nanoscopy and live-cell imaging, we observed that microtubules within the AIS appeared highly dynamic, a feature essential for the TDB. Pathomechanistically, amyloid-beta insult caused cofilin activation, f-actin remodeling and subsequent impaired microtubule dynamics in the AIS. Concomitantly, the AIS/TDB sorting function failed, causing AD-like Tau missorting. <br /> In summary, we provide evidence that the Tau isoforms differ in physiological and pathological axodendritic sorting, and that the axodendritic distribution of Tau depends on AIS integrity and maintenance of microtubule dynamics. Current mouse models mainly expressing only human 2N4R-Tau isoform will have to be reevaluated due to the particular distribution and function of this usually very little expressed isoform.