Influence of endocrine status on small ruminant sperm freezing response

Abstract

Assisted reproductive technology improves livestock management and allows the storage of valuable genetic material of wild and domestic species in germplasm banks. Nevertheless, the use of frozen-thawed sperm for artificial insemination does not provide the desirable fertility rates in small ruminants. The present study aimed <em>i</em>) to investigate the effect of rutting season, <em>in vitro</em> hormone supplementation, sperm source and capacitation status on sperm freezability and <em>ii</em>) to identify candidate markers of sperm freezing ability by analyzing sperm proteome in wild and domestic small ruminant species. Samples were collected from Iberian ibex (<em>Capra pyrenaica</em>), Mouflon (<em>Ovis musimon</em>), Chamois (<em>Rupicapra pyrenaica</em>), domestic Merino rams (<em>Ovis aries</em>) and domestic Murciano-Granadina bucks (<em>Capra hircus</em>). Sperm was cryopreserved by conventional slow-freezing in straws and by ultrarapid-freezing in pellets. Sperm proteome was assessed by liquid chromatography - mass spectrometry.<br /> Sperm cryoresistance was lower in the middle of the rutting season, when the seasonal peak of testosterone and prolactin occurs, than at the end of the rutting season. <em>In vitro</em> supplementation with testosterone or prolactin decreased the post-thaw acrosome integrity in both domestic ram and buck. Sperm freezability was also affected by sperm source, being higher in epididymal than in ejaculated sperm. Levels of phosphorylation associated with capacitation status were higher in ejaculated than in epididymal sperm. Incubation under capacitating conditions induced an increase of tail phosphorylation in both types of sperm. Proteome studies revealed 25 proteins to be more abundant at the end of the rutting season than in the middle of the rutting season in wild species and, at the same time, more abundant in epididymal than in ejaculated sperm, hence these proteins were strongly associated with higher sperm freezability across species and across conditions of study.<br /> This study shows substantial changes of the sperm proteome during the rutting season and upon ejaculation in small ruminants. These findings contribute to select the most suitable moment of the year to cryopreserve sperm samples to be stored in genetic resource banks. The identification of candidate markers of sperm freezability elucidated in the present study could be further investigated and used as supplements in freezing extenders to improve sperm functionality after doing artificial insemination with frozen-thawed semen.

<strong>Einfluss des endokrinen Status auf das Einfrieren von Spermien kleiner Wiederkäuer: Verwendung von Wild- und Hauswiederkäuern als Versuchsmodell</strong><br /> Die assistierte Fortpflanzungstechnologie verbessert die Tierhaltung und ermöglicht die Speicherung von wertvollem genetischem Material wilder und heimischer Arten in Keimplasmabanken. Die Verwendung von gefrorenem und aufgetautem Sperma zur künstlichen Befruchtung führt jedoch bei kleinen Wiederkäuern nicht zu den gewünschten Fruchtbarkeitsraten. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, <em>i</em>) den Einfluss der Brunstzeit, der In-vitro-Hormonsupplementierung, der Spermienquelle und des Kapazitätsstatus auf die Einfrierbarkeit der Spermien zu untersuchen und <em>ii</em>) mögliche Marker für das Einfrieren der Spermien durch Analyse des Spermienproteoms bei kleinen Wild- und Hauswiederkäuern zu identifizieren. Die Proben wurden von Iberischen Steinböcken (<em>Capra pyrenaica</em>), Mufflon (<em>Ovis musimon</em>), Gämsen (<em>Rupicapra pyrenaica</em>), einheimischen Merinowiddern (<em>Ovis aries</em>) und einheimischen Murciano-Granadina-Böcken (<em>Capra hircus</em>) gesammelt. Das Sperma wurde durch herkömmliches langsames Einfrieren in Strohhalmen und durch ultraschnelles Einfrieren in Pellets kryokonserviert. Die Analyse des Spermaproteom erfolgte durch eine Flüssigkeits-Chromatographie mit Massenspektroskopie.<br /> Die Kryoresistenz der Spermien war in der Mitte der Brunstzeit, wenn der saisonale Höhepunkt von Testosteron und Prolaktin auftritt, geringer als am Ende der Brunstzeit. Eine In-vitro-Supplementation mit Testosteron oder Prolaktin verringerte die Unversehrtheit der Akrosomen nach dem Auftauen sowohl im einheimischen Widder als auch im Bock. Die Einfrierbarkeit der Spermien wurde auch durch die Spermienquelle beeinflusst und war in Nebenhoden höher als in ejakulierten Spermien. Der mit dem Kapazitätsstatus verbundene Phosphorylierungsgrad war bei ejakulierten Spermien höher als bei epididymalen Spermien. Die Inkubation unter kapazitiven Bedingungen bewirkte einen Anstieg der Schwanzphosphorylierung bei beiden Spermatypen. Die Proteomstudie ergaben, dass 25 Proteine am Ende der Brunstzeit eine höhere Expression am Ende als in der Mitte der Brunstzeit bei Wildarten aufzeigten sowie häufiger im Nebenhoden als bei ejakulierten Spermien beobachtet wurden, weshalb diese Proteine in engem Zusammenhang mit einer höheren Einfrierbarkeit der Spermien in den unterschiedlichen Spezies und den Untersuchungsansätzen der Studie stehen.<br /> Diese Studie zeigt wesentliche Veränderungen des Spermienproteoms während der Brunstzeit und nach der Ejakulation bei kleinen Wiederkäuern. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, den geeignetsten Zeitpunkt des Jahres für die Kryokonservierung von Spermienproben zur Aufbewahrung in genetischen Ressourcenbanken auszuwählen. Die Identifizierung von Kandidaten-Markern für die Einfrierbarkeit von Spermien, die in der vorliegenden Studie aufgeklärt wurden, könnte weiter untersucht und als Ergänzung für Einfrier-Extender verwendet werden, um die Spermienfunktionalität nach einer künstlichen Besamung mit gefrorenem und aufgetautem Sperma zu verbessern.