Post calving metabolic status dependent changes on expression of extracellular vesicle coupled microRNAs in bovine follicular fluid and blood serum

Abstract

Most high yielding dairy cows enter a state of negative energy balance (NEB) during early lactation. This phenomenon is associated with disturbed metabolic status of the cows reflected in the blood and follicular fluid (FF) microenvironment leading to ovarian dysfunction. Extracellular vesicles (EVs) are evolutionarily conserved communicasomes with cargo molecules found in most biological fluids including follicular fluid and they transport different bioactive molecules such as miRNAs, proteins, and lipids from donor to recipient target cells. This dissertation is aimed to investigate the association between post-calving metabolic status and the expression of EV-coupled miRNAs in FF and blood serum of Holstein-Friesian cows. Moreover, the effect of lactation physiology on the expression of EV-coupled miRNAs in FF and blood serum was conducted by comparing lactating cows and heifers. For this, FF samples were collected from large follicles using ovum pick-up procedure from cows (n=30) at weeks 5-10 of post-calving. FF samples collected from heifers (n=8) were used as a control. Parallel to FF collection, blood samples were collected from all experimental animals. Screening of the energy balance status of cows was performed using blood metabolite concentration, body weight, and overall energy based on dry matter intake prior to sample pooling. Following this, EVs were isolated from pooled FF and serum samples using ultracentrifugation and miRNAs expression analysis was performed using Illumina based Next-generation sequencing. Results of energy balance analysis revealed that the majority of the cows (66%) were transient (TCs), whereas the remaining cows exhibited either always negative (ANCs) (17%) or always positive (APCs) (17%). Sequencing results revealed that, a total of 356 and 179 known miRNAs across all samples were detected in FF and serum samples, respectively. Hierarchical clustering and pairwise differential expression analysis of EV-coupled miRNAs in FF and serum revealed major downregulation of miRNAs in metabolically stressed cows. Furthermore, specific EV-coupled miRNAs (bta-miRNA-122, bta-miRNAs-150, bta-miRNA-9-5p, and bta-miRNA-196) were commonly detected with similar pattern of expression in ANCs vs heifers in serum and FF. Moreover, comparison of APCs vs heifers revealed that, lactation has induced the expression of EV-coupled miRNAs in FF but not in the blood serum. In conclusion, cows with divergent metabolic status showed distinct pattern of expression of EV-coupled miRNAs, which can be excellent input for further studies aiming at development of noninvasive molecular indicator of metabolic stress in dairy cows.

<strong>Veränderungen der Expression extrazellulärer Vesikel-gekoppelter microRNAs in Rinderfollikelflüssigkeit und Blutserum in Abhängigkeit vom Stoffwechselstatus nach dem kalben</strong><br /> Die meisten Hochleistungsmilchkühe geraten während der frühen Laktation in einen Zustand der negativen Energiebilanz (NEB). Dieses Phänomen ist mit einem gestörten Stoffwechselstatus der Kühe verbunden, der sich in der Mikroumgebung von Blut und Follikelflüssigkeit (FF) widerspiegelt und zu Funktionsstörungen der Eierstöcke führt. Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind evolutionär konservierte Signalträger die mit verschiedenen Molekülen beladen sind. Sie kommen in den meisten biologischen Flüssigkeiten, einschließlich Follikelflüssigkeit und transportieren verschiedene bioaktive Moleküle wie miRNAs, Proteine und Lipide von der Spender- zur Empfängerzielzelle. In dieser Dissertation sollte der Zusammenhang zwischen dem Stoffwechselstatus nach dem Abkalben und der Expression von EV-gekoppelten miRNAs in FF und Blutserum von Holstein-Friesian-Kühen untersucht werden. Darüber hinaus wurde die Auswirkung der Laktationsphysiologie auf die Expression von EV-gekoppelten miRNAs in FF und Blutserum durch Vergleich von laktierenden Kühen mit Färsen analysiert. Zu diesem Zweck wurden FF-Proben von großen Follikeln in den Wochen 5 bis 10 nach dem Abkalben, unter Verwendung der Ovum pick up Methode, von Kühen (n = 30) entnommen. FF-Proben von Färsen (n = 8) wurden als Kontrolle verwendet. Parallel zur FF-Entnahme wurden von allen Versuchstieren Blutproben entnommen. Das Screening des Energiebilanzstatus von Kühen erfolgte durch die Analyse der Blutmetabolitenkonzentration, des Körpergewichts und der Gesamtenergie basierend auf der Trockenmasseaufnahme vor dem Sammeln der Proben. Anschließend wurden EVs aus gepoolten FF- und Serumproben mittels Ultrazentrifugation isoliert, und die Expressionsanalyse der miRNAs wurde unter Verwendung von Illumina-basierter Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt. Die Ergebnisse der Energiebilanzanalyse ergaben, dass die Mehrheit der Kühe (66%) Transient (TCs) waren, während die übrigen Kühe entweder immer negativ (ANCs) (17%) oder immer positiv (APCs) (17%) waren. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass insgesamt 356 und 179 bekannte miRNAs in allen FF- bzw. Serumproben nachgewiesen wurden. Das hierarchische Cluster- und die paarweise differentiellen Expressionsanalysen von EV-gekoppelten miRNAs in FF und Serum ergaben eine starke Herunterregulierung von miRNAs in metabolisch gestressten Kühen. Darüber hinaus wurden spezifische EV-gekoppelte miRNAs (bta-miRNA-122, bta-miRNAs-150, bta-miRNA-9-5p und bta-miRNA-196) häufig mit ähnlichen Expressionsmustern in ANCs im Vergleich zu Färsen in Serum und FF nachgewiesen. Weiterhin ergab der Vergleich von APCs mit Färsen, dass die Laktation die Expression von EV-gekoppelten miRNAs in FF induziert hat, nicht jedoch im Blutserum. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass Kühe mit unterschiedlichem Stoffwechselstatus ein deutliches Expressionsmuster für EV-gekoppelte miRNAs aufweisen. Dies ist eine wichtige Erkenntnis für weitere Studien, die auf die Entwicklung eines nicht-invasiven molekularen Indikators für metabolischen Stress bei Milchkühen abzielen.