Effect of cow’s metabolic status on the epigenome profile of oocytes and embryos

Abstract

In lactating cows, intensive genetic selection for improved milk production has been associated with reduced reproductive capacity, leading to increased early embryo loss. During post-calving lactation, the cow’s dietary intake is outmatched by the energy needed for biological processes causing the cow to enter a state of negative energy balance, associated with a perturbed metabolism. This thesis project aimed to investigate the impact of this transient metabolic stress on the epigenetic profile of genes involved in developmental competency of gametes and embryos in lactating cows. To do so, oocytes were collected during early and mid postpartum period from metabolically profiled multiparous cows as well from nulliparous heifers. Comparatively, <em>in vitro</em> derived early cleaving embryos were cultured <em>in vivo</em> in lactating cows as well as heifers to morula stage and collected through uterine flushing. Epigenetic profile of both samples was assessed by whole genome bisulfite sequencing. <br /> Metabolic profiling revealed that selected lactating cows exhibited significantly higher levels of non-esterified fatty acids and beta-hydroxybutyrate during early post-partum and embryo transfer than nulliparous heifers. Accordingly, genome-wide hypomethylation of early post-partum oocytes was observed, and mid postpartum oocytes genomic feature methylation was similar to heifer’s oocytes. Inversely, embryos from lactating cows were generally hypermethylated when compared to heifers. Further methylation profiling of early postpartum oocytes revealed 32,990 differentially methylated regions in early postpartum oocytes overlapping genes involved in metabolic pathways, carbon and fatty acid metabolism. Similarly, embryos grown in lactating cows revealed 13,383 differentially methylated regions in genes involved in metabolic and fatty acid biological processes, as well as trophoblast invasion and embryo implantation. Both oocytes and embryos collected from metabolically stressed animals revealed differentially methylated regions of genes involved in lipid metabolic processes, and imprinted genes putatively acquired during maturation that must be maintained during embryo development. <br /> Taken together, these studies demonstrate that transient metabolic stress associated with early lactation influences epigenetic status of oocytes and embryos of genes involved in developmental competency. Genes found in signaling pathways provide novel candidates for effector supplementation of these signaling molecules both during oocyte maturation and embryo culture to ultimately improve reproductive processes in lactating cows.

<strong>Einfluss des Stoffwechselstatus der Milchkuh auf das epigenetische Profil von Eizellen und Embryonen</strong><br /> Bei laktierenden Kühen führt eine intensive genetische Selektion auf eine verbesserte Milchproduktion zu einer verminderten Fortpflanzungsfähigkeit, die mit einem erhöhten frühen Embryoverlust verbunden ist. Während der Hochlaktation nach der Kalbung wird der Nährstoffbedarf der Kuh durch die Energie, die für biologische Prozesse benötigt wird, versorgt. Das führt dazu, dass die Kuh in einen Zustand der negativen Energiebilanz kommt, was wiederum mit einem abnormalen Metabolisum verbunden ist. Diese Arbeit zielte darauf ab, die Auswirkungen dieser transienten metabolischen Belastung auf das epigenetische Profil von Gameten und Embryonen bei laktierenden Kühen zu untersuchen und Genomregionen zu identifizieren, die durch den metabolischen Stress bei Milchkühen anfällig für epigenetische Veränderungen sind. Dazu wurden Eizellen während der frühen und mittleren postpartum Perioden von metabolisch auffälligen multiparösen Kühen sowie von nulliparen Färsen entnommen. Im Vergleich dazu wurden <em>in vitro</em> gewonnene frühe, sich entwickelnde Embryonen <em>in vivo</em> in laktierende Kühe sowie Färsen bis zum Morula-Stadium kultiviert und durch Uterusspülung gesammelt. Das epigenetische Profil der Eizellen und Embryonen aus beiden Experimenten wurde mittels der Genom Bisulfit Sequenzierung untersucht.<br /> Das metabolische Profiling ergab, dass die ausgewählten laktierenden Kühe signifikant höhere Werte von nicht veresterten Fettsäuren und Beta-Hydroxybutyrat aufwiesen als die Färsen während des frühen post-partum und Embryotransfers. Dementsprechend wurde eine genomweite Hypomethylierung der frühen post-partum Eizellen beobachtet und es zeigte sich, dass das genomische Methylierungsprofil der späten post-partum Eizellen ähnlich zu den Eizellen von Färsen war. Umgekehrt waren Embryonen von laktierenden Kühen generell hypermethytliert im Vergleich zu den Färsen. Das weitere Methylierungs-Profiling der frühen post-partum Eizellen ergab 32.990 differentiell methylierte Regionen. Dabei konnten Gene ermittelt werden die an verschiedenen Stoffwechselwegen wie dem Kohlenstoff- und Fettsäure-Stoffwechsel beteiligt sind. Ebenso zeigten Embryonen die sich in laktierenden Kühen entwickelten 13.383 unterschiedlich methylierte Genregionen, die sowohl an biologischen Stoffwechsel- und Fettsäureprozessen als auch an der Trophoblasteninvasion und der Embryoimplantation beteiligt sind. Sowohl Eizellen als auch Embryonen, die von metabolisch gestressten Tieren entnommen wurden, zeigten unterschiedlich methylierte Regionen bei Genen die am Fettstoffwechsel beteiligt sind sowie geprägte Gene, die vermutlich während der Reifung erworben wurden und die während der Embryoentwicklung erhalten werden müssen.<br /> Zusammenfassend zeigten diese Studien, dass transienter metabolischer Stress in der frühen Laktation den epigenetischen Status von Eizellen und Embryonen in Genregionen beeinflusst, die an der Entwicklungskompetenz beteiligt sind. Gene, die in diesen Signalwegen gefunden wurden, sind neue Kandidaten für zukünftige Untersuchung zur Entwicklung von molekularen oder epigenetischen Marker die auf verschiedene Umweltfaktoren einschließlich dem metabolischen Stresses bei Milchkühen sensitiv reagieren.