Der Einfluss von Neddylierung auf Oligodendrozyten und die Myelinisierung im Zebrafisch

Abstract

Neddylierung ist eine posttranslationale Modifikation, welche verwandt ist mit der Ubiquitinierung. Durch kovalente Konjugation des Proteins NEDD8 (Neural precursor cell expressed developmentally downregulated 8) an spezifische Ziele werden u. a. Konformationsänderungen induziert und Protein-Protein Interaktionen gefördert. Blockade der Neddylierung in Neuronen führt zur Ausbildung rigider Filopodien anstelle von dendritischen Spines. In Bezug auf die Neddylierung in Oligodendrozyten sowie deren Einfluss auf die Myelinisierung existieren bisher keine weiterführenden Studien. Hierbei ummanteln dünne Myelinschichten durch Aktin-Polymerisierung und –Depolymerisierung Axone; wird die Neddylierung inhibiert, zeigt sich ein Shift in der F/G-Aktin Ratio. Ziel dieser Arbeit war daher, mögliche Einflüsse der Neddylierung auf die Myelinisierung und Aktin-Polymerisierung im Zebrafisch zu identifizieren. <br /> Zunächst erfolgte der Nachweis der für die Neddylierung relevanten Gene im Zebrafisch mittels RT-PCR. Um die Neddylierung zu inhibieren wurden anschließend drei Verfahren getestet: Injektion von MLN4924 (Active Biochem) inhibiert die Neddylierung im kompletten Fisch, ebenso wie die Injektion von NEDD8- bzw. NEDD8Like-blockierenden Morpholinos (Gene Tools LLC). Injektion eines Plasmides, welches eine mutierte Version der E2-Ligase Ubc12 enthielt, wurde genutzt, um die Neddylierung in Oligodendrozyten selektiv zu hemmen. Die minimale Gruppengröße bei Injektionen lag bei 170 und positive wie negative Kontrollgruppen wurden in jede Kohorte integriert. Längenmessungen wurden unter einem Stereomikroskop (Stemi 508, Karl Zeiss AG) durchgeführt, zur Auswertung wurde die Software NIS Elements Basic Research (Nikon) verwendet. Western Blots wurden zur Protein-Analyse verwendet. Die Visualisierung der Oligodendrozyten erfolgte mittels eines TriMScope II Zwei-Photon Mikroskops (LaVision GmbH). Vermessung der Oligodendrozyten wurde mittels ImageJ durchgeführt. Für alle statistischen Analysen wurde GraphPad Prism 6 verwendet. <br /> Zebrafische mit eingeschränkter Neddylierung aufgrund der Morpholino- (NEDD8, NEDD8L, kombiniert) oder MLN4924-Injektion wiesen eine signifikant reduzierte Körperlänge an 5 dpf auf (NEDD8 und NEDD8L: 3,3 mm, kombiniert: 3,2 mm, MLN: 3,0 mm, Positiv- und Negativ-Kontrolle: 3.7 mm). Western Blots zeigten eine Reduktion von NEDD8 im gesamten Fisch. Nach Plasmid-Injektion fielen bei den einzelnen Oligodendrozyten mit blockierter Neddylierung irreguläre Internodien (bspw. Knötchenbildung, Kaliberschwankungen) auf, welche in der Kontrollgruppe nicht beobachtet wurden. Die statistische Analyse ergab einen gleichmäßig linearen Verlauf von Kontroll-Internodien sowie eine deutliche Abweichung von dieser Norm bei Internodien mit Mutationsexpression (Windungen, Knicke; p = 0,0014). <br /> Die vorliegenden Daten lassen eine Störung der Myelinisierung durch Oligodendrozyten bei Inhibierung der Neddylierung vermuten. Eine Korrelation von Neddylierung und Aktin-Polymerisierung konnte noch nicht nachgewiesen werden. Nichtsdestotrotz konnte durch die vorliegende Arbeit ein weiterer für die Myelinisierung essenzieller Signalweg identifiziert werden. Dies könnte die zukünftige Therapie von demyelinisierenden Erkrankungen beeinflussen.