Search for exosomes in NG2-glial cells

Abstract

NG2-glial cells is an abundant and widely distributed subtype of glia, featuring properties not typically associated with mature glial cells, such as the ability to receive synaptic input from neurons, or adult proliferation. Fast information flow from neurons to NG2-glia through synapses was confirmed in several studies. The goal of such a fast communication is not known. It was suggested that neuronal activity through innervation of NG2-glia controls its differentiation into myelinating oligodendrocytes. In grey matter, where myelination requirements are low, the purpose of NG2-glia remains unclear. Our preliminary results suggested exosome release from NG2-glia model cells in vitro. <br /> In our project, we searched for exosome release from NG2-glia in different in situ and in vitro preparations using both functional and morphological approach. In functional approach we established a membrane capacitance recording technique using patch clamp method. The technique however proved insufficient to confirm or deny exosomal release from Oli-neu cell line or NG2-glial cells in situ. <br /> In the imaging approach, we used laser confocal microscopy to identify structures candidate for exosomes. In the process, we identified that one of the marker proteins, Flotillin-1, features a previously undescribed association with NG2-glial cells in hippocampus. We quantified this association using large-scale semi-automated detection of fluorescent markers. Using correlated light-electron immune microscopy (CLEM) we were able to establish the morphology of Flotillin-1-positive structures in NG2-glial cells, identifying them as lysosomes or late endosomes. We also supported the previous observations which described Flotillin-1 in association with age pigment lipofuscin in pyramidal neurons. Flotillin-1 was previously described in astrocytes, however, our data does not support this observation. <br /> Despite not providing new evidence for exosomal release from NG2-glial cells, our research identified new putative marker for NG2-glial cells, Flotillin-1. Strong subcellular association of Flotillin-1 with cytosolic side of NG2-glial cell lysosomes also reveals an obscure parallel of NG2-glial cells with hippocampal neurons, in which Flotillin-1 is known to sparsely label the cytosolic side of telolysosomes, the residual bodies containing the ageing pigment, lipofuscin. Our work may provide new tools to interact with NG2-glial cells, as well as potential for yet unknown functionality of these glial cells. The Flotillin-1-mediated connection between neurons and NG2-glial cells may prove valuable for future studying of neuronal ageing and deposition diseases.

<strong>Поиск экзосом в глиальных NG2-клетках</strong> <br /> Глиальные NG2-клетки многочисленны и встречаются во всех отделах ЦНС, и имеют ряд необычных свойств. Они имеют синаптические контакты с нейронами в качестве принимающей стороны, и способны к пролиферации на протяжении всей жизни. Быстрая передача информации от нейронов к NG2-глии через синапсы была подтверждена в нескольких исследованиях. Предназначение этой информации в настоящий момент неясно. Предполагается, что активность нейронов через синаптические контакты регулирует дифференциацию NG2-глии в миелинизирующие олигодендроциты. Однако в сером веществе, где потребность в миелинизации сравнительно невелика, присутствие NG2-глии вызывает вопросы. Предварительные данные нашего исследования предположили выброс экзосом из NG2-глии, как возможный механизм обратной связи между NG2-глией и нейронами. <br /> В нашем исследовании, мы произвели поиск экзосом в NG2-глии in situ и in vitro, с функциональной и с морфологической точек зрения. В рамках функционального подхода, мы внедрили метод записи электрической ёмкости клеточных мембран методом patch clamp. Данный метод, однако, оказался недостаточен для однозначного подтверждения либо опровержения выброса экзосом из NG2-глии в ткани мозга либо из модельной клеточной линии Oli-neu. В рамках морфологического подхода, мы использовали лазерную конфокальную микроскопию для поиска внутриклеточных структур в NG2-глии, имеющих признаки вовлечения экзосомального пути. В процессе анализа полученных данных один из маркеров экзосомального пути, Flotillin-1, выявил ранее неизвестную структурную взаимосвязь с NG2-глией в гиппокампе. Мы количественно охарактеризовали эту взаимосвязь используя полуавтоматический анализ флуоресцентных маркеров в крупной серии изображений. Используя коррелированную свето-электронную микроскопию (CLEM) мы смогли установить внутриклеточную принадлежность Flotillin-1-позитивных структур, которую мы определили как относящуюся к лизосомам либо поздним эндосомам. Мы также подтвердили ранее описанную связь Flotillin-1 с возрастным пигментом липофусцином, формирующим отложения в пирамидных нейронах в течение жизни. Наши данные не позволяют подтвердить встречающиеся в литературе описания Flotillin-1 как связанного с астроцитами. <br /> Несмотря на отсутствие новых доказательств экзосомальной функции в глиальных NG2-клетках, наше исследование выявило новый потенциальный маркер для NG2-глии, Flotillin-1. Достоверная внутриклеточная взаимосвязь Flotillin-1 с цитозольной стороной лизосом в NG2-глии также раскрывает ранее неизвестную параллель между NG2-глией и пирамидными нейронами гиппокампа. В пирамидных нейронах, Flotillin-1 сравнительно слабо метит цитозольную поверхность телолизосом, остаточных телец содержащих возрастной пигмент, липофусцин. Наша работа раскрывает новые возможности для взаимодействия с NG2-глией, а также указывает на новые потенциальные функции этого типа клеток. Flotillin-опосредованная параллель между нейронами и NG2-глией в будущем может оказаться ценной для исследований в области старения нейронов и болезней накопления.