Mikropartikel von Inflammasom-aktivierten Endothelzellen reduzieren die Lebensfähigkeit vaskulärer Zellen

Abstract

<strong>Hintergrund:</strong> Inflammation ist ein fundamentaler Mechanismus der Atherosklerose und ihrer Folgeerkrankungen wie koronare Herzerkrankung, Myokardinfarkt oder Schlaganfall. Grundlage hierfür ist die bei der Atherosklerose charakteristischerweise vorzufindende Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms sowie die Freisetzung zirkulierender Mikropartikel durch vaskuläre Zellen. Das NLRP3-Inflammasom ist ein multimerer Protein-Komplex, der infolge der Wahrnehmung von Gefahrensignalen wie ATP, Cholesterinkristallen oder oxidiertem LDL aktiviert wird. Es verursacht die Freisetzung der Zytokinen IL-1ß und IL-18 sowie einen Zelltod durch Pyroptose. Mikropartikel sind extrazelluläre Vesikel einer Größe von 100-1000nm, welche von der Zellmembran eukaryotischer Zellen absprießen. Ihre Funktion als Signaltransduktionmechanismus erfüllen die Mikropartikel dabei durch den Transfer ihrer Inhaltsstoffe wie Zytokinen, Chemokinen, Enzymen, messenger RNA oder microRNA, sowie durch die Übertragung membranverankerter Moleküle. Erhöhte Zahlen zirkulierender Mikropartikel tragen zur Entstehung und Progression kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Effekte und zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismen von Mikropartikeln, freigesetzt von Inflammasom-aktivierten Endothelzellen, offenzulegen.<br /> <strong>Methoden und Resultate:</strong> Zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms wurden Endothelzellen mithilfe der Inflammasomaktivatoren LPS und Nigericin behandelt. Nachfolgend wurden aus dem Überstand dieser Zellen durch differentielle Zentrifugation Mikropartikel (EMP) isoliert, mit denen schließlich humane koronararterielle Endothelzellen (HCAEC) und glatte Muskelzellen (HCASMC) inkubiert wurden. Der Nachweis der Inkorporation von EMP durch ihre Zielzellen gelang durch Färbungen mithilfe der Membranfarbstoffe PKH 26 und PKH67. Durch anschließend durchgeführte mikroskopische Untersuchungen konnte die Aufnahme der Mikropartikel zur Darstellung gebracht werden. Validiert wurde die tatsächliche Aufnahme der Mikropartikel dabei zum einen durch mehrfache Waschung der Präparate vor ihrer Fixierung, zum anderen durch Z-Stapelaufnahmen, welche eine dreidimensionale Darstellung der jeweiligen Zielzellen gestatteten. Eine zellschädigende Wirkung von EMP ließ sich mithilfe mehrerer Methoden verifizieren. Nach Stimulation von HCASMC mit EMP konnte so unter Verwendung von Viability Assays eine signifikante Reduktion der Lebensfähigkeit der Zielzellen beleuchtet werden. Korrespondierend dazu zeigte sich nach Behandlung von HCAEC mit EMP eine Zunahme der Zytotoxizität. Weiterhin beobachteten wir unter Zuhilfenahme von Scratch Assays, dass es infolge der Behandlung von HCASMC mit EMP zu einer Erweiterung der initial zugefügten Läsion gekommen war, während sich bei der unbehandelten Gruppe eine Schließung derselbigen zeigte. Zur Beleuchtung der zugrundliegenden Mechanismen schlossen wir RTD-PCR- sowie ELISA-Experimente an, welche die Hochregulation bzw. Ausschüttung charakteristischer Mediatoren des NLRP3-Inflammasoms zur Darstellung brachten. Eine Reduktion der zytotoxischen Effekte der Mikropartikel zeigte sich, nachdem sie mithilfe des Inflammasominhibitors Isoliquiritigenin behandelt worden waren.<br /> <strong>Schlussfolgerung:</strong> Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms ist durch Mikropartikel-vermittelte interzelluläre Kommunikation übertragbar und ruft in den Empfängerzellen den Zelltod hervor. Es ist anzunehmen, dass Mikropartikel, die infolge von Inflammasomaktivierung freigesetzt werden, eine wesentliche Rolle in der Entstehung und Progression der Atherosklerose innehaben.