Carvedilol-mediated signal transduction at the β₂ adrenergic receptor

Abstract

G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the most prominent family of membrane proteins in the mammalian genome. They are required to relay extracellular cues into a cellular response. The environmental interactions conveyed by GPCRs are involved in a myriad of physiological processes, which makes them prominent drug targets. GPCRs respond to a wide variety of extracellular stimuli, ranging from ions and small molecules to hormones and even to physical cues like radiation to activate guanine-nucleotide binding proteins (G proteins). Yet, only seven G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and four arrestin (arr) proteins regulate their response. <br /> The classical tenet of G protein-coupled receptor signaling states that the receptor acts as ligand-induced guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for the heterotrimeric G protein. Subsequently, G protein-coupled receptor kinases in concert with arrestins modulate the induced response. However, the past two decades have broadened the contributions of arrestins beyond mere desensitization. The paradigm, denoted as arrestin-biased signaling, imparts the distinction between arrestins and G proteins to function as parallel signaling transducers downstream of G protein-coupled receptors (GPCR) and implies that the receptor's response can be tailored by developing ligands that favor one over the other signaling branch. Biased signaling, in terms of preferentially activating either G proteins or arrestins, is a paradigm that holds promising implications for devising safer and more efficient therapeutic interventions. <br /> The third-generation β-blocker Carvedilol is an essential drug in the treatment of cardiovascular diseases. Especially in the treatment of heart failure, Carvedilol is among the most effective β-blockers. However, the mechanistic underpinnings that impart Carvedilol with its propitious clinical profile are still elusive. Arrestin-biased signaling at the β₂AR is among the auspicious characteristics of Carvedilol and was proposed to explain survival benefits in patients suffering from heart failure. <br /> Here, we intended to shed light on the mechanistic underpinnings of the β₂ adrenergic receptor (β₂AR) antagonist, Carvedilol. By utilizing the CRISPR/Cas9 technology, we explicitly dissect G protein- from arrestin-mediated signaling. We find, using primary or recombinant cells endogenously or overexpressing β₂ARs, along with computational and a variety of biological, biochemical, and signaling assays, that Carvedilol indeed signals but relies on G proteins to drive all detectable activation via the β₂AR. <br /> The results of our studies complement the current literature and highlight an alternative mechanism to rationalize the observed effects upon Carvedilol treatment. Our investigations emphasize the extent of intrinsic sympathomimetic activity (ISA) as a means to rationalize the signaling behavior of Carvedilol, and most likely, the entire group of β-blocking reagents. Moreover, it broadens the scope of future research on β-blockers as the precise knowledge of the molecular mechanism modulated by therapeutic drugs is vital for the interpretation of basic research and clinical data, to device proper therapies and to guide the rational design of pharmacological agents with improved therapeutic efficacy.

<strong>Carvedilol-induzierte Signaltransduktion am ß₂ adrenergen Rezeptor</strong> <br /> G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranproteinen im Säugergenom und werden benötigt, um extrazelluläre Stimuli in eine zelluläre Antwort umzuwandeln. Die hierdurch vermittelten Interaktionen mit der Umgebung sind an einer Vielzahl physiologischer Prozesse beteiligt, was GPCRs zu einem geeigneten Ziel für Arzneimittel macht. Während verschiedenste extrazelluläre Stimuli in der Lage sind, rezeptorvermittelt Guanosintriphosphat-bindende Proteine (G Proteine) zu aktivieren, sind sieben G Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) gemeinsam mit vier Arrestinen an der Regulation der Signale beteiligt. <br /> In dem klassischen Model der GPCR vermittelten Signaltransduktion begünstigt der GPCR liganden-induziert, den Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) zu Guanosintriphosphat (GTP) in der GTPase-Domäne des G Proteins. Anschließend erkennen GRKs den aktivierten Rezeptor und phosphorylieren diesen an intrazellulär exponierten Serin- und Threonin Resten. Der phosphorylierte Rezeptor wiederum vermag es Arrestine zu binden und zu aktivieren, was die Desensitisierung des Rezeptors zur Folge hat. <br /> Der Gedanke des “Arrestin-biased signaling” jedoch hebt die Trennung von G Proteinen als Initiatoren und Arrestinen als Modulatoren der Reizweiterleitung auf und besagt, dass sowohl G Proteine als auch Arrestine, unabhängig voneinander, rezeptorvermittelte Signale induzieren können, welche in unterschiedlichen physiologischen Effekten münden und ebnet so den Weg für die Entwicklung neuer Arzneimittel mit geringerem Nebenwirkungspotential. <br /> Carvedilol ist ein ß-Blocker der dritten Generation, eingesetzt in der Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Besonders in der Therapie der Herzinsuffizienz ist Carvedilol einer der effektivsten Vertreter dieser Gruppe von Arzneimitteln. Nichtsdestotrotz sind die molekularen Grundlagen, welche Carvedilol seine vorteilhaften Eigenschaften verleihen, bislang nicht gänzlich geklärt. Die Fähigkeit, ß₂AR-vermittelt, präferentiell Arrestine zu aktivieren wurde früh mit einer erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit assoziiert. <br /> Die Fortschritte auf dem Feld der CRISPR/Cas9 Technologie haben dazu geführt, dass wir G Protein- und Arrestin vermittelte Signale, durch genetischen knock-out, sauber voneinander unterscheiden können. Sowohl im rekombinanten Zellkontext als auch in Primärzellen, sowie nach Überexpression und unter endogener Rezeptorexpression konnten wir unter Zuhilfenahme von computergestützten Modellsystemen und verschiedenen biologischen und biochemischen Messmethoden zeigen, dass Carvedilol den ß₂AR zu aktivieren vermag und dass die Rezeptoraktivierung nach Behandlung mit Carvedilol komplett G Protein abhängig ist. <br /> Die Resultate dieser Arbeit fügen sich in die bereits bestehende Literatur ein, verdeutlichen jedoch einen alternativen Mechanismus der Carvedilol-induzierten Signaltransduktion. Unsere Untersuchungen verdeutlichen, dass das Ausmaß an ISA ein wichtiger Parameter ist, um den Nutzen und das Risiko von Carvedilol, und vermutlich der gesamten Klasse der ß-Blocker, einzuschätzen und unterstützen somit die Interpretation der Grundlagenforschung und klinischer Daten um den zielgerichteten Einsatz und die Entwicklung neuer Medikamente voranzutreiben.