Optogenetische Stimulation des nativen Herzmuskels durch Adeno-assoziierte Virustransduktion von Channelrhodopsin-2

Abstract

Die Optogenetik ist eine innovative Methode, die die transgene Expression von lichtsensitiven Proteinen verwendet zur elektrophysiologischen oder biochemischen Stimulation von Zellen durch Beleuchtung. Das Beleuchten mit blauem Licht der Wellenlänge von &lambda; = 470 nm löst in lichtsensitiven Kardiomyozyten, die den Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimieren, eine Depolarisation mit anschließendem Aktionspotential aus (Boyden et al., 2005; Nagel et al., 2003). Dies ermöglicht eine optogenetische Stimulation von Herzen, was zuvor <em>in vivo</em> im transgenen Zebrafisch-Embryo und in der adulten Maus gezeigt wurde, wobei in diesen transgenen Tiermodellen alle Kardiomyozyten das ChR2 Protein exprimierten (Arrenberg et al., 2010; Bruegmann et al., 2010). Der nächste Schritt zu einer medizinischen Therapie als optogenetischer Herzschrittmacher oder Defibrillator, ist daher der Gentransfer von Channelrhodopsin-2 in ein natives, nicht transgenes Herz. <br />Die vorliegende Arbeit untersuchte zwei Applikationswege für Adeno-assoziierte Virusvektoren, um eine stabile Expression von ChR2 im Mausherz zu erreichen: 1. Die lokale Injektion direkt in das Myokard und 2. die systemische Injektion über die Blutbahn durch Punktion einer Vene. Beide Methoden resultierten in Genexpression von ChR2 im nativen Herzen und erfolgreicher optischer Stimulierbarkeit.<br />Die lokale Injektion von AAV2/1-CAG-hChR2-mCherry ermöglichte im Bereich der Injektionsstelle die optische Stimulation des Myokards. Die Stimulierbarkeit des Herzens dauerte jedoch nur drei Wochen an. Darüber hinaus wurde neben dem Verlust der optischen Stimulierbarkeit auch ein Verlust von ventrikulären Myokardgewebe festgestellt. Durch histologische Analysen wurde im Bereich der Injektionsstelle eine Infiltration von Leukozyten nachgewiesen und fibrotisches Narbengewebe gefunden. <br />Die systemische Injektion von AAV2/9-CAG-hChR2-mCherry ermöglichte die optische Stimulation des Herzens über beide Ventrikel und über das rechte Atrium. Durch die Fluoreszenz des mit ChR2 fusionierten mCherry Proteins wurde die Expression von ChR2-mCherry in allen Bereichen des Herzens in 58 % der Herzmuskelzellen nachgewiesen. Die optische Stimulierbarkeit wurde bereits 4 Wochen nach der Injektion von 2 x 10¹¹ gc AAV2/9-CAG-hChR2-mCherry festgestellt und hielt nachweislich bis zu 16 Monate an. In histologischen Analysen dieser Herzen wurden keine Anzeichen für negative Immunreaktionen oder Narbengewebe gefunden. Durch <em>in vivo</em> und <em>ex vivo</em> Stimulationsanalysen wurden die unteren Grenzwerte der Lichtintensität ermittelt, die für eine optische Stimulation notwendig waren. Weiterhin war eine zehn Minuten andauernde Stimulation durch Lichtimpulse ohne Aussetzer des Herzschlags möglich. Der künstlich beschleunigte Herzrhythmus kehrte nach der Lichtstimulation sofort zum normalen Sinusrhythmus zurück. Die optische Stimulation hatte somit keinen negativen Einfluss auf die kardiale Elektrophysiologie. <br />Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass die optische Herzstimulation nach Gentransfer von ChR2 ein großes Potential für eine therapeutische Anwendung als optogenetischer Herzschrittmacher hat.