Biotechnologische Produktion der Plattformchemikalie Succinat durch das Darmbakterium <em>Phocaeicola vulgatus</em>

Abstract

Aufgrund des steigenden Interesses an nachhaltigen Produktionsprozessen nimmt der Umstieg einer petrochemischen Produktion von Bulk-Chemikalien hin zu einer mikrobiellen Synthese immer mehr an Bedeutung zu. Im Fokus dessen steht ebenfalls die biobasierte Herstellung von Succinat aus nachwachsenden Rohstoffen. Da <em>P. vulgatus</em> entsprechende Enzymsysteme für den Abbau komplexer, pflanzlicher Polysaccharide besitzt und durch dessen Verstoffwechselung große Mengen an Succinat produziert, ist dieser Organismus ein vielversprechender Kandidat für eine nachhaltige Succinat-Produktion. Prinzipiell ist für eine biotechnologische Produktion von Plattformchemikalien eine zielgerichtete Manipulation des Stoffwechsels des Modelorganismus von Vorteil. Dafür muss der entsprechende Organismus allerdings genetisch zugänglich sein, sodass das Einbringen von rekombinanter DNA in die Zelle, sowie die Deletion chromosomaler Gene, umsetzbar ist. Unter Verwendung des <em>shuttle</em>-Vektors pG106 und des genomintegrativen Vektors pMM656 wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst bestätigt, dass ein Transfer von Fremd-DNA in <em>P. vulgatus</em> möglich ist. Weiterhin wurde untersucht, ob durch eine Überexpression von Genen der zentrale Stoffwechsel von <em>P. vulgatus</em> gezielt modifiziert werden kann. Hierbei führte die homologe Überexpression des für die D-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gens <em>bvu_2499</em> (<em>ldh</em>) zu einer Verschiebung des Produktspektrums hin zu einer 10-fachen Steigerung der Lactatproduktion. <br /> Als anaerober Fumarat-Atmer bildet <em>P. vulgatus</em> Succinat natürlicherweise über den reduktiven und oxidativen Abschnitt des nicht-geschlossenen Citratzyklus, wobei die zellulär relevante Succinat-Produktion auf dem reduktiven Teil basiert. Da für die Bildung von Succinat im Zuge der anaeroben Fumarat-Atmung Reduktionsäquivalente ([H]) benötigt werden, wurden in dieser Arbeit Gene überexprimiert, welche an [H]-generierenden Stoffwechselwegen beteiligt sind. Dabei resultierte die homologe Überexpression der Aconitase aus dem oxidativen Teil des Citratzyklus in einer Steigerung der Succinat-Ausbeute um 13 %. Die Überproduktion der Transketolase aus dem Pentosephosphatweg führte zu einer 35 %-igen Steigerung der Succinat-Produktion im Vergleich zum Wildtyp. <br /> Im Hinblick auf eine biobasierte Succinat-Produktion ist aus industrieller Sicht ein Produktionsstamm ideal, welcher aus nachwachsenden Rohstoffen ausschließlich Succinat bildet. Neben Succinat synthetisiert <em>P. vulgatus</em> jedoch die Endprodukte Acetat, Lactat, Formiat und Propionat. Für die Generierung eines Homosuccinat-Produzenten wurde in der vorliegenden Arbeit eine dreifache Deletionsmutante (<em>P. vulgatus</em> &Delta;0309-10 &Delta;2449 &Delta;2880) generiert, welche durch die Deletion der D-Lactat-Dehydrogenase und Pyruvat-Formiat-Lyase, sowie durch das Ausschalten des Propionat-Synthesewegs, nur noch Succinat und Acetat als Endprodukte bildete. Dadurch konnte eine Steigerung der Succinat-Ausbeute um 95 % im Vergleich zum Wildtyp erzielt werden.