Einfluss genetischer Varianten auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren in der kraniofazialen Entwicklung

Abstract

Die Identifizierung genetischer Risikovarianten für multifaktorielle Erkrankungen ist in den letzten Jahren rasant vorangeschritten. Dies gilt auch für nicht-syndromale Lippenspalten mit oder ohne Gaumenspalten (nsCL/P), eine der häufigsten Fehlbildungen des Menschen. Die Translation der genetischen Befunde in biologische Erkenntnisse stellt jedoch eine Herausforderung dar, da viele mit der Krankheit assoziierte genetische Varianten in nicht-kodierenden Regionen des Genoms liegen. Ein möglicher funktioneller Effekt könnte eine veränderte Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre Bindestellen sein. In der vorliegenden Studie wurden Transkriptionsfaktorbindestellen von Transcription factor AP-2 alpha (TFAP2A), einem nsCL/P Kandidatengen, in Zellen des humanen Gaumenmesenchyms (HEPM-Zellen) untersucht. Im Rahmen einer Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) und anschließender Sequenzierung identifizierten wir 2.845 Regionen mit TFAP2A Bindung (TFAP2A ChIP-seq Peaks). Im Abgleich mit Chromatinmarkern aus humanem embryonalem kraniofazialem Gewebe das Carnegiestadiums 15 und TFAP2A ChIP-seq Peaks aus humanen Zervixkarzinomzellen konnten 802 potentiell für kraniofaziales Gewebe spezifische TFAP2A ChIP-seq Peaks mit möglicher Enhanceraktivität identifiziert werden. Basierend auf einer Gen-Ontologie-Analyse zeigte sich eine mögliche Funktion von TFAP2A in relevanten Prozessen wie der epithelial-mesenchymalen Transition und in regulatorischen Netzwerken mit anderen Genen der kraniofazialen Entwicklung, wie MSX1 und SPRY2. Wir konnten 18 Regionen mit allelspezifischer Bindung von TFAP2A erfassen. Eine Integration mit einer Metaanalyse von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) zu nsCL/P von Ludwig et al. (2017) zeigte jedoch keine Überlappung der TFAP2A ChIP-seq Peaks mit genomweit signifikanten nsCL/P Risikoloci. Limitationen der Studie waren, dass allelspezifische Effekte nur an in unserem Zellmodell heterozygoten SNPs untersucht werden und dass dieses nur begrenzt die biologischen Gegebenheiten im embryonalen Gaumen simulieren konnten. In zukünftigen Studien können diese Einschschränkung mittels genomischer Editierung und komplexerer in-vitro und in-vivo Modelle überwunden werden. Unser Versuchsansatz kann auf andere Phänotypen und Transkriptionsfaktoren übetragen werden.

<strong>Allele-specific transcription factor binding in a cellular model of orofacial clefting</strong><br> Non-syndromic cleft lip with/without cleft palate (nsCL/P) is a frequent congenital malformation with multifactorial etiology. While recent genome-wide association studies (GWAS) have identified several nsCL/P risk loci, the functional effects of the associated non-coding variants are largely unknown. Furthermore, additional risk loci remain undetected due to lack of power. As genetic variants might alter binding of transcription factors (TF), we here hypothesized that the integration of data from TF binding sites, expression analyses and nsCL/P GWAS might help to (i) identify functionally relevant variants at GWAS loci, and (ii) highlight novel risk variants that have been previously undetected. Analysing the craniofacial TF TFAP2A in human embryonic palatal mesenchyme (HEPM) cells, we identified 2845 TFAP2A ChIP-seq peaks, several of which were located near nsCL/P candidate genes (e.g. MSX1 and SPRY2). Comparison with independent data suggest that 802 of them might be specific to craniofacial development, and genes near these peaks are enriched in processes relevant to nsCL/P. Integration with nsCL/P GWAS data, however, did not show robust evidence for co-localization of common nsCL/P risk variants with TFAP2A ChIP-seq peaks. This data set represents a new resource for the analyses of craniofacial processes, and similar approaches with additional cell lines and TFs could be applied to generate further insights into nsCL/P etiology.