Enzymatische Herstellung und Reinigung von Fructooligosacchariden des Inulin-Typs und deren Verwertung durch abundante Darmbakterien

Abstract

Fructooligosaccharide vom Inulin-Typ (I-FOS) sind präbiotische Fructan-Oligomere, die hauptsächlich aus ß-(2,1)-verknüpften Fructose-Einheiten bestehen. I-FOS haben aufgrund ihrer gesundheitsfördernden Wirkung und funktionellen Eigenschaften in der Lebensmittelindustrie und im medizinischen Bereich erhebliche Bedeutung erlangt. Die hohen Kosten für die Herstellung von I-FOS begrenzen jedoch ihre breitere Anwendung, weshalb anhaltendes Interesse an neuen biotechnologischen Produktionsstrategien besteht. Diese Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines alternativen enzymatischen Herstellungsverfahrens von I-FOS aus Saccharose mit Hilfe der bakteriellen Inulosucrase InuGB-V3 aus <em>Lactobacillus gasseri</em>. <br /> Zur Analyse der synthetisierten I-FOS wurde zunächst eine isokratische HPLC-Methode entwickelt und validiert. I-FOS mit einem Polymerisierungsgrad (DP) von 3-17 konnten innerhalb von 45 Minuten basisliniengetrennt eluiert werden, was eine nützliche Verbesserung gegenüber bestehenden isokratischen HPLC-Verfahren darstellt. Durch heterologe Produktion der Inulosucrase in <em>Escherichia coli</em> BL21 wurde eine hohe Proteinausbeute von 139 mg InuGB-V3 pro L <em>E. coli</em> Kultur erzielt. Das gereinigte Zelllysat (InuGB-V3-Rohenzym) wurde als Biokatalysator in I-FOS-Synthesereaktionen unter verschiedenen Bedingungen eingesetzt. Durch Charakterisierung des InuGB-V3-Rohenzyms und einer darauf basierenden Optimierung der grundlegenden Prozessparameter konnten die Produktausbeute und die Effizienz des Prozesses erhöht werden. In der optimierten Biokonversions-Reaktion mit 800 g L^-1 Saccharose wurden I-FOS mit einem DP von 3-11 synthetisiert, wobei 1,1-Kestotetraose (DP4) das vorherrschende Transfructosylierungs-Produkt war. Die erzielte I-FOS-Konzentration von 401 g L^-1 und die I-FOS-Ausbeute von 0,50 g I-FOS pro g Saccharose sind die bisher höchsten für eine bakterielle Inulosucrase beschriebenen Werte und zeigen die Wettbewerbsfähigkeit des entwickelten Produktionsverfahrens mit bestehenden Verfahren. Der Großteil der in der Produktlösung verbliebenen hochkalorischen Zucker Glucose, Saccharose und Fructose konnte mit Aktivkohle entfernt werden, wodurch die I-FOS-Reinheit auf 89 % erhöht wurde. <br /> Anschließend wurden die aufgereinigten I-FOS als Substrat in Wachstumsversuchen mit kommensalen, abundanten Bakterien der menschlichen Darmflora eingesetzt. Vergleichend wurden Kultivierungen mit pflanzenbasierten I-FOS, Inulin und Levan-artigen Fructanen (ß-(2,6)-verknüpfte Fructose-Einheiten, potenzielle Präbiotika) durchgeführt. <em>Ruminococcus gnavus</em>, <em>Agathobacter rectalis</em>, <em>Dorea formicigenerans</em> und <em>Parabacteroides johnsonii</em> zeigten bei Kultivierung mit den durch InuGB-V3 synthetisierten I-FOS stärkeres Wachstum als mit den anderen Fructanen. Diese überlegenen wachstumssteigernden Eigenschaften der I-FOS (InuGB-V3) gegenüber den anderen Fructanen eröffnen die Möglichkeit, die bakteriellen I-FOS gezielt zur starken Förderung einiger Darmbakterien einzusetzen.