Erweiterung der genetischen Werkzeuge für das Darmbakterium Phocaeicola vulgatus zur Untersuchung des Katabolismus und des Phenolsäure-Stoffwechsels
Erweiterung der genetischen Werkzeuge für das Darmbakterium Phocaeicola vulgatus zur Untersuchung des Katabolismus und des Phenolsäure-Stoffwechsels
View/Type of Scholarly Publication
DissertationDate of Exam
01.02.2024Date of Publication
26.02.2024Advisor
Deppenmeier, UweCo-Referee
Dahl, ChristianeMetadata
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Abstract
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Erweiterung der genetischen Zugänglichkeit des relevanten Darmbakteriums Phocaeicola (P.) vulgatus mit dem Ziel, eine reproduzierbare und zuverlässige Methode zur markerlosen Deletion von chromosomalen Gensequenzen für Organismen der Gattungen Bacteroides/Phocaeicola zu etablieren. Sowohl mittels neu-entwickelter, als auch bestehender genetischer Systeme für Bacteroides/Phocaeicola-Spezies wurde der zentrale Kohlenstoff-Stoffwechsel und Phenolsäure-Metabolismus in P. vulgatus untersucht und modifiziert, um festzustellen, ob sich P. vulgatus als Plattform-Organismus für eine biotechnologische Produktion der Phenolsäuren Phenylessigsäure und Cumarsäure eignet. Um ein Deletionssystem für die markerlose Deletion von Genen in P. vulgatus zu etablieren, wurde die Levansucrase sacB aus Bacillus subtilis als Gegenselektionsmarker in P. vulgatus evaluiert. Mithilfe des Shuttle-Vektors pG106 sowie des genomintegrativen Vektors pMM656 wurde das sacB-Gen heterolog in P. vulgatus exprimiert. P. vulgatus Stämme mit einem intakten sacB-Gen zeigten eine letale Sensibilität gegenüber Saccharose. Auf Basis von pMM656 wurde ein modulares Deletionsplasmid entwickelt, welches zuverlässig mittels Konjugation in P. vulgatus übertragen werden kann. Als „Proof Of Concept“ für die in dieser Arbeit entwickelte Deletionsmethode wurde das Gen bvu_1663 aus P. vulgatus deletiert. bvu_1663 kodiert für eine Exo-β-Fructosidase und ist essenziell für die Verwertung von Levan- und Inulin-basierten Fructooligosacchariden (FOS). Die Deletionsmutante P. vulgatus Δ1663 war nicht in der Lage, Levan- oder Inulin-FOS zu verwerten und erlaubte die Aufklärung des Fruktan-Stoffwechsels in P. vulgatus. Im Hinblick auf die Produktion von Phenolsäuren wurde in P. vulgatus ein neuartiger Stoffwechselweg postuliert und analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass P. vulgatus in der Lage ist, ausgehend von Phenylalanin Phenylessigsäure, unter Freisetzung von ATP, zu generieren. Zusätzlich konnte, durch die homologe Überproduktion der Aminotransferase BVU_2275 in P. vulgatus, die Menge an Phenylalanin, welche maximal in den Stoffwechselzweig eingeschleust werden konnte, erhöht werden. Dies resultierte in einer sechsfachen Steigerung der Phenylessigsäure-Produktion. Durch eine Kombination von bioinformatischen Analysen und In vitro Charakterisierungen, wurde weiterhin eine Tyrosin-Ammoniak-Lyase (TAL, BVU_1010) in P. vulgatus identifiziert, welche sich potenziell für die biotechnologische Produktion von p-Cumarsäure eignet. Obwohl die kinetischen Charakteristika von BVU_1010 im Bereich bekannter TAL liegt, führte eine homologe Überproduktion von BVU_1010 in P. vulgatus nicht zu einer nachweisbaren Produktion von Cumarsäure. In dieser Arbeit wurden somit die ersten Aufklärungsarbeiten für die potenzielle Entwicklung einer biotechnologischen Produktion von Phenolsäuren durch Phocaeicola/Bacteroides-Spezies geleistet.
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieRelated Publications
https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2023.102742Neff, André: Erweiterung der genetischen Werkzeuge für das Darmbakterium Phocaeicola vulgatus zur Untersuchung des Katabolismus und des Phenolsäure-Stoffwechsels. - Bonn, 2024. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-74641
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-74641
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