Charakterisierung des mitochondrialen Stresssensors Pink1 während der Mitophagie

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der zentralen Frage der Regulation von Pink1, einer Parkinson-assoziierten Kinase, die in gesunden Zellen als mitochondrialer Stresssensor agiert. Als Folge auf eine starke Akkumulation von Pink1 an geschädigten Mitochondrien wird Parkin, eine E3 Ubiquitin Ligase rekrutiert und durch Pink1 aktiviert. Dadurch wird ein Prozess des selektiven, autophagischen Abbaus des geschädigten Organells ausgelöst, der auch Mitophagie genannt wird. Wie die Regulierung von Pink1 selbst stattfindet und welche zellulären Stressbedingungen eine Pink1-Akkumulation auslösen war zum Zeitpunkt der vorliegenden Arbeit noch weitgehend unerforscht. <br> Es konnte gezeigt werden, dass der Anstieg des Pink1-Levels nicht strikt mit der Depolarisierung des mitochondrialem Membranpotenzials einhergeht und der zelluläre Pink1-Umsatz zu einem geringen Teil durch das Proteasom, sowie durch zelluläre Expression reguliert wird. Einerseits führte die Inhibierung der Translation zu einem starken Rückgang der Pink1-Akkumulierung, während andererseits mittels Luziferase-basierender Pink1-Promotoranalyse ein Anstieg der Pink1-Expression während Mitophagie-stimulierenden Bedingungen dargestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten auf ein neues Modell zur Pink1-Regulation hin, welches auf einer simultanen Co-Regulation durch Degradation und Expression basiert. Um die Rolle von Pink1 genauer zu charakterisieren, wurden Untersuchungen an einer CRISPR/Cas9-generierten Pink1 KO Zelllinie durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass Mitophagie in der Pink1 KO-Zelllinie durch exogenes Pink1 bei einer der definierten Pink1-Stresskonditionen wiederhergestellt werden konnte. Zudem bildet das exogene Pink1 den charakteristischen funktionalen Pink1-Komplex aus. Um zu analysieren, ob weitere Faktoren eine Rolle bei der Regulation von Pink1 spielen, wurden massenspektrometrisch Interaktionspartner von Pink1 unter Standard- und Stressbedingungen identifiziert. Unter diesen konnte die mitochondriale Phosphatase Pgam5 identifiziert werden, die in Abhängigkeit des Δψ mit Pink1 interagiert und maßgeblich an der Expression und damit Regulation von Pink1 beteiligt ist.

The Parkinson's disease associated Pink1 kinase acts as a mitochondrial stress sensor in healthy cells. In this process, Pink1 accumulates at high levels on the outer membrane of damaged mitochondria and recruits and activates Parkin. Thereby, Parkin initiates the process of selective autophagic degradation of the damaged organelle, a process called mitophagy. Nevertheless, the regulation of Pink1 itself has not been definitively explored. <br> In this thesis, the issue of Pink1 regulation was addressed in more detail by first defining cellular stress conditions that lead to Pink1 accumulation. It was shown that the increase in Pink1 level is not strictly accompanied by depolarization of the mitochondrial membrane potential and that cellular Pink1 turnover is regulated only in small part by the proteasome, but mainly by cellular expression. Here, on the one hand inhibition of translation showed a strong decrease in Pink1 accumulation and on the other hand luciferase-based Pink1 promoter analysis was used to show an increase in Pink1 expression while mitophagy-inducing conditions. In this regard, this work demonstrates a new Pink1 regulatory model based on a simultaneous co-regulation by degradation and expression. Furthermore, a CRISPR/Cas9 generated Pink1 KO cell line was created and characterized. We show that exogenous Pink1 restores mitophagy and forms the functional Pink1 complex in the Pink1 KO cell line only in the presence of one of the stress conditions defined for Pink1 accumulation. Mass spectrometric analysis of Pink1 complex partners revealed several potential interaction partners under standard and stress conditions, including the mitochondrial phosphatase Pgam5. This work also demonstrated that a membrane potential-dependent physical interaction exists between Pink1 and Pgam5. In the course of this dissertation, it was found that Pgam5 influences Pink1 expression and thus its regulation.