Charakterisierung der NLRP3-abhängigen und -unabhängigen IL-1β-Freisetzung in Makrophagen

Abstract

Interleukin (IL)-1β ist ein primärer Botenstoff, der für die Vermittlung von Entzündungen verantwortlich ist und damit eine zentrale Rolle bei zahlreichen Krankheiten spielt. Bisher wird die IL-1β-Freisetzung allerdings häufig in Makrophagen aus dem Knochenmark von Mäusen untersucht. In dieser Arbeit sollen Signalwege charakterisiert werden, die zur Freisetzung von NLRP3-abhängiger und -unabhängiger IL-1β-Freisetzung in humanen Makrophagen führen. THP-1 und U937 Makrophagen dienten dabei als <em>in vitro</em> Modelle, um die IL-1β-Freisetzung am Beispiel von P2X7 (Rezeptor), Ap4 (Ligand) und HDAC6 (regulierendes Protein) zu untersuchen.<br /> Aktivierung des P2X7-Rezeptors durch Adensointriphosphat (ATP) und 2,3-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP) erhöhte die IL-1β-Freisetzung in geprimten Makrophagen. Die pharmakologische Hemmung oder ein genetischer Knockout von NLRP3 hemmten die IL-1β-Freisetzung nicht vollständig. Die Erhöhung von extrazellulärem K⁺ sowie die Hemmung von Caspase-1 oder Serinproteasen hielten die IL-1β-Freisetzung in Makrophagen, die mit P2X7-Rezeptor-Agonisten stimuliert wurden, zu 50% aufrecht. Die Ergebnisse deuten auf die Existenz eines bisher unerkannten NLRP3-unabhängigen Mechanismus der durch den P2X7-Rezeptor-vermittelten IL-1β-Freisetzung hin.<br /> Ebenso positionieren die Ergebnisse Adenosintetraphosphat (Ap4), ein ATP-Derivat, als Induktor von IL-1β-bedingten Entzündungen. Trotz struktureller Ähnlichkeiten zu ATP vermittelte Ap4 die IL-1β- Freisetzung unabhängig von einer P2X7-Rezeptoraktivierung. Trotzdem erfolgte die Ap4-induzierte IL-1β-Freisetzung ebenfalls NLRP3-unabhängig, was die Existenz eines NLRP3-unabhängigen Signalweges in menschlichen Makrophagen unterstreicht und auf einen unerkannten Mechanismus der Spaltung von Pro-IL-1β in seine aktive Form hinweist.<br /> Außerdem wurde mittels der <em>proteolysis targeting chimeras</em> (PROTAC)-Strategie die Beteiligung der Histondeacetylase 6 (HDAC6) an der NLRP3-vermittelten IL-1β-Freisetzung untersucht. Das HDAC6-PROTAC LS-91 verringerte die HDAC6-Proteinspiegel. Die IL-1β-Freisetzung verringerte sich allerdings sowohl durch LS-91 als auch durch das Kontroll-PROTAC SLW118 konzentrationsabhängig, was darauf hindeutet, dass ein HDAC6-Abbau nicht für die Hemmung der NLRP3-vermittelten IL-1β-Freisetzung notwendig ist. Es konnte festgestellt werden, dass die Hemmung der katalytischen Domäne mit niedermolekularen HDAC-Inhibitoren ausreicht, um die IL-1β-Freisetzung zu reduzieren. Daher konnte gezeigt werden, dass die enzymatische Aktivität von HDAC6 für die Funktion des NLRP3-Inflammasoms entscheidend ist.<br /> Die Untersuchungen dieser Arbeit verdeutlichen die artspezifischen Unterschiede in der Funktionalität von Makrophagen zwischen Maus und Mensch und liefern neue Einblicke in die Signalgebung der IL-1β-Freisetzung in humanen Makrophagen.