Investigation of the lysosomal proteome in neuronal ceroid lipofuscinosis caused by CLN6 deficiency and interactome studies to identify novel interaction partners of CLN6

Abstract

Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) account for the majority of genetic neurodegenerative diseases in infancy. However, for most forms of this serious disease there is no adequate treatment available. In the NCL6 subtype, which is caused by deficiency in ceroid- lipofuscinosis neuronal protein 6 (CLN6), poor understanding of CLN6’s function and its pathomechanisms impede the development of a proper treatment. Therefore, this thesis comprises a detailed examination of pathological changes in the lysosome and investigations to identify novel interaction partners of CLN6 with the purpose to elucidate its function. First, mass spectrometric analysis of the lysosomal fraction from wild-type (wt) and nclf mouse liver were conducted, which for the first time presented a large-scale study of proteomic changes in CLN6 deficiency and indicated a significant depletion of specific lysosomal proteins. This reduction of mainly soluble hydrolases was validated through examining selected proteins by western blotting of tritosomes as well as 20.000 g brain and liver pellets from wt and nclf mice. However, western blots of whole liver and brain lysates in comparison to the lysosomal fractions showed no differences or even an increase in the protein amount of most investigated proteins, which might indicate an impaired transport to the lysosome. Second, the BioID approach was applied for CLN6 and resulted in numerous proteins, which are located in close proximity of CLN6 and, therefore, are potential interaction partner candidates. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays of selected candidates from the BioID data sets verified an association of CLN6 with the chaperones calnexin (CANX) and calreticulin (CALR), which are known interaction partners of lysosomal soluble hydrolases.<br> This thesis contributes to a better understanding of the development of NCL6 and the molecular biology of CLN6 in multiple ways. The investigations of the lysosomal proteome provide with the reduction of many lysosomal hydrolases a concrete link to CLN6’s function and a conceivable explanation for the accumulation of storage material in CLN6 deficiency. The interaction partner studies provide an enormous number of proteins, which are acting in various different biological pathways and are potentially associated with CLN6. The inclusion of a considerable number of proteins playing a role in the calnexin-cycle along with CANX and CALR, whose association with CLN6 was validated by the BiFC assay, suggest an involvement of CLN6 in the biogenesis of lysosomal proteins and potentially also a direct interaction with soluble hydrolases in the endoplasmic reticulum (ER).

Neuronale Ceroid-Lipofuszinosen stellen die am häufigsten vorkommenden genetisch bedingten neurodegenerativen Erkrankungen im Kindesalter dar. Für die meisten Formen dieser ernsten Krankheit sind jedoch keine angemessenen Behandlungsmöglichkeiten vorhanden. Ebenso wie bei der NCL6 Form, die durch einen Defekt im CLN6 Protein hervorgerufen wird. Das Ziel dieser Arbeit war, einen Beitrag zur Aufklärung der Funktion von CLN6 zu leisten. Hierzu wurden zwei Ansätze verfolgt: eine detaillierte Untersuchung der pathologischen Veränderungen im Lysosom und Versuche zur Identifikation von CLN6 Interaktionspartner. Zunächst wurden massenspektrometrische Analysen der lysosomalen Fraktion von wildtyp und nclf Mausleber durchgeführt, die erstmals ein umfassendes Bild von proteomischen Veränderungen bei einem CLN6 Defekt lieferten und einen signifikanten Verlust spezifischer lysosomaler Proteine anzeigten. Diese Verringerung hauptsächlich löslicher Hydrolasen wurde durch den Nachweis ausgewählter Proteine in Western Blots aus 20.000 g Gehirn- und Leberpellet Proben von wt und nclf Mäusen bestätigt. Außerdem zeigten Western Blots von Lysaten der gesamten Leber und des gesamten Gehirns für den Großteil der untersuchten Proteine keinen Unterschied bzw. sogar einen Anstieg der Proteinmenge bei CLN6 Defizienz an, was auf einen beeinträchtigten Transport oder eine fehlerhafte Verarbeitung hinweisen könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die BioID Methode für CLN6 angewandt und ergab eine große Anzahl von Proteinen, die sich in unmittelbarer Nähe von CLN6 befinden und daher potenzielle Interaktionspartner darstellen.<br> Diese Arbeit trägt in mehrfacher Hinsicht zu einem besseren Verständnis der Krankheitsentstehung bei NCL6 und der Molekularbiologie von CLN6 bei. Die Untersuchungen des lysosomalen Proteoms liefern mit der Verringerung vieler lysosomaler Hydrolasen eine konkrete Verbindung zur Funktion von CLN6 und eine denkbare Erklärung für die Akkumulation von Speichermaterial bei CLN6 Defizienz. Des Weiteren liefern die Interaktionspartnerstudien eine enorme Anzahl von Proteinen, die möglicherweise mit CLN6 in Verbindung stehen und in ganz unterschiedlichen biologischen Prozessen mitwirken. Eine beträchtliche Anzahl von diesen Proteinen einschließlich CANX und CALR, deren engere Verbindung zu CLN6 in Fluoreszenzkomplementationstests bestätigt wurde, spielen eine Rolle in der Prozessierung glykosylierter Proteine und deuten darauf hin, dass CLN6 an der Biogenese lysosomaler Proteine und möglicherweise auch an einer direkten Interaktion mit löslichen Hydrolasen im ER beteiligt ist.