Untersuchungen zur β-Arrestin 2 Rekrutierung und lateralen Mobilität von 5HT_1a-Rezeptoren allein sowie unter dem Einfluss koexprimierter 5HT_2a- bzw. 5HT₇₂-Rezeptoren

Abstract

Dem 5HT_1a-Rezeptor (5HT_1aR) wird in der Familie der Serotoninrezeptoren besondere Aufmerksamkeit zuteil, da er eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Serotonin-Systems im Gehirn einnimmt.1,2 Darüber hinaus ist seine Funktion für physiologische Prozesse wie Schlaf und Stressantwort, aber auch für Erkrankungen wie Depressionen und Angststörungen wichtig.3–6 Um die Pathomechanismen dieser Erkrankungen umfassend aufklären zu können, ist es von essentieller Bedeutung, die Funktion der beteiligten Rezeptoren vollständig zu verstehen. Dazu wird im Rahmen dieser Arbeit die Kinetik der β-Arrestin 2 Rekrutierung an den 5HT_1aR mit Hilfe von 5HT_1aR-NanoBiT^®-Assays in transient transfizierten HEK 293 Zellen (HEK Zellen) analysiert. Der prototypische 5HT_1aR-Agonist 8 OH DPAT kann dabei auf Basis der aus der Kinetik der β Arrestin 2 Rekrutierung zu bestimmenden Initialen Rate (IR) als Partialagonist eingestuft werden. Für den 5HT_1aR-Agonist U92016A stellt sich eine Initiation des Signals in vollagonistischer Weise dar, die Gegenregulation des Signals erfolgt jedoch so stark, dass die über 60 min rekrutierte β Arrestin 2 Menge der eines Partialagonisten gleicht. <br /> Das Verständnis von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) hat sich in den letzten Jahrzehnten immer weiter dahin entwickelt, GPCR nicht als isolierte Einheiten zu verstehen, sondern sie im Kontext ihrer Signalproteine sowie anderer GPCR zu sehen. Es ist zudem bekannt, dass 5HT_1aR mit den Serotoninrezeptoren 5HT_2a und 5HT₇ (5HT_2aR, 5HT₇R) oligomerisieren. <br /> So wird mittels 5HT_1aR-NanoBiT^®-Assays in HEK Zellen überprüft, wie sich die Koexpression und Aktivierung der 5HT_2aR auf die β Arrestin 2 Rekrutierung an 5HT_1aR auswirken. Dabei ist eine deutlich reduzierte Rekrutierung von β Arrestin 2 an den 5HT_1aR zu verzeichnen. <br /> Die Signaltransduktion von GPCR kann maßgeblich von der lateralen Mobilität der beteiligten Proteine in der Zellmembran abhängen. Im Rahmen von Single Particle Tracking (SPT) Experimenten soll daher untersucht werden, wie sich die Koexpression des 5HT_2aR auf die laterale Mobilität von 5HT_1aR auswirkt. Dazu werden HEK Zellen stabil transfiziert, die SNAP-5HT_1aR alleine oder in Kombination mit HiBiT-5HT_2aR überexprimieren. Dabei ist unter anderem festzustellen, dass 5HT_2aR die laterale Mobilität von 5HT_1aR deutlich modulieren. So nehmen besonders im unbehandelten Zustand in den langsam diffundierenden (S2) und immobilen Rezeptorzuständen (S1) die Diffusionskoeffizienten für 5HT_1aR ab, der Anteil der 5HT_1aR im schnell diffundierenden Zustand (S3) sinkt unter 5HT_2aR-Koexpression. Zu welchem Maß die gezeigten Veränderungen auf die Heteromerisierung der 5HT-Rezeptoren zurückzuführen ist, welche Rolle eine mögliche Internalisierung der 5HT_1aR spielt oder welche Einflüsse aufgrund von nachgeschalteten Signalkaskaden vermittelt werden, wird im Rahmen dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden können. <br /> Auch die Effekte der Koexpression und Aktivierung von 5HT7R auf die β-Arrestin 2 Rekrutierung an den 5HT_1aR werden im 5HT_1aR-NanoBiT^®-Assay analysiert. Dabei zeigt sich, dass 5HT7R die β-Arrestin 2 Rekrutierung an den 5HT_1aR nicht verändern. Stattdessen kann der 5HT7R-Agonist AS-19 als inverser 5HT_1aR-Agonist identifiziert werden. Mit Hilfe von SPT-Experimenten ist zu untersuchen, ob die Reduktion der konstitutiven 5HT_1aR-Aktivität durch AS-19 oder den inversen 5HT_1aR-Agonisten Spiperon mit einer Veränderung der lateralen 5HT_1aR-Mobilität einhergeht. Die Behandlung der hierfür verwendeten HEK SNAP-5HT1a Zellen mit AS-19 oder Spiperon hat keinen signifikanten Effekt auf die laterale 5HT_1aR-Mobilität.