Untersuchung der Liponsäureassemblierung an LbpA in schwefeloxidierenden Bakterien: Aufklärung der Substratspezifität der Lipoat:Protein-Ligase sLpl(AB)

Abstract

In dieser Doktorarbeit wurden umfassende bioinformatische und Protein-biochemische Untersuchungen zur Liponsäureassemblierung an LbpA durchgeführt, einem essenziellen Liponsäure-bindenden Protein der dissimilatorischen Schwefeloxidation assoziiert mit dem sHdr-Multienzymkomplex. <br /> Die Forschung konzentrierte sich auf mehrere zentrale Aspekte der Funktionsweise der Assemblierung des Cofaktors an GcvH, LbpA1 und LbpA2 sowie auf die Substratspezifität der Lipoat:Protein-Ligasen aus repräsentativen Mikroorganismen, die zusätzlich den Liponsäureassemblierungsweg an LbpA durchführen im Vergleich zu <em>E. coli</em>, der ausschließlich den kanonischen Liponsäureassemblierungsweg an GcvH und Lipoyldomänen innerhalb der E2-Untereinheiten bekannter a-Ketosäuredehydrogenasen durchführt. <br /> Ein zentrales Ergebnis der Arbeit war die Identifizierung der für die phylogenetische Trennung verantwortlichen Aminosäuren von GcvH, LbpA1 und LbpA2. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die Substratspezifität der untersuchten Lipoat:Protein-Ligasen durch komplementäre Oberflächenladungen der Polypeptide bestimmt wird. Diese Theorie konnte durch den Austausch konservierter, basischer Aminosäuren in einem heterolog exprimierten LbpA2-Proteins <em>in vitro</em> bekräftigt werden. <br /> Weiterhin wurde der Mechanismus der sich gegenseitig anziehenden, komplementären Oberflächenladungen von sLpl(AB) und LbpA auch für die Interaktion zwischen LipB und GcvH in Betracht gezogen. Wachstumsexperimenten an <em>H. denitrificans &Delta;tsd</em>A <em>&Delta;slpl</em>(AB) <em>lbp</em>A-His deuten in dem Zusammenhang auf eine fehlende Aktivität von LipB an LbpA-Proteinen hin. <br /> Da die Oxidoreduktase LipT ebenfalls einen großen negativ geladenen Oberflächenausschnitt in der Nähe des aktiven Zentrums aufweist, zudem eine tunnelartige Struktur zum FAD-Cofaktor hin aufweist, die eine Interaktion zu Lipoyl-LbpA nahe legt, wurden einführende Versuche zur Untersuchung einer möglichen Dihydroliponamid-Dehydrogenase-Funktion von LipT durchgeführt, die diese Hypothese untermauern. <br /> Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein Modell für die differenzierte Liponsäureassemblierung von GcvH und LbpA in schwefeloxidierenden Bakterien wie <em>H. denitrificans</em> aufgestellt, die das sHdr-LbpA-System besitzen. Die Hypothese besagt, dass nur die Liponsäure-bindenden Proteine mit dem Cofaktor beladen werden, die unter den gegebenen Umweltbedingungen für ihre katalytische Aktivität benötigt werden, und der Organismus entsprechend zwischen der Lipoylierung Proteine GcvH und LbpA wechselt, abhängig davon, welches Protein für den jeweiligen Stoffwechselweg benötigt wird. <br /> Ein weiterer bedeutender Fortschritt dieser Arbeit war die Etablierung eines optimierten CRISPR/Cas9-basierten Mutagenesesystems für <em>H. denitrificans</em>. <br /> Zusammenfassend konnte die Arbeit wichtige molekulare Mechanismen der Liponsäureassemblierung an LbpA in schwefeloxidierenden Bakterien aufklären und ein neues Mutagenesesystem etablieren, das zukünftige Forschungsarbeiten in diesem Bereich wesentlich erleichtern wird.