Das Bioenergetische Profil präimplantativer Rinderembryonen - Spezifische Effekte der In vitro Kultivierung und der Kryokonservierung

Abstract

Ein beständiges Thema in der In-vitro Produktion (IVP) von Rinderembryonen ist die beeinträchtigte Entwicklungskompetenz. Diese lässt sich durch eine verminderte Kryotaug-lichkeit und geringeren Implantationsraten nachweisen und korreliert mit veränderten embryonalen Eigenschaften, einschließlich des Energiestoffwechsels. Auswirkungen der IVP und der Kryokonservierung auf die mitochondriale Funktionalität zur Energieerzeugung, sind derzeit nicht vollständig geklärt, würden aber zukünftig zur Klärung der embryonalen Vitalität beitragen. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass die mitochondriale Funktionalität mit der embryonalen Vitalität korreliert. Hierzu wurde das bioenergetische Profil von Rinderembryonen verschiedener Entwicklungskompetenzen bestimmt und miteinander verglichen. Es wurde untersucht, inwiefern sich das bioenergetische Profil 1) in IVP-Embryonen vs. In-vivo erzeugten Embryonen, 2) durch eine schnellere- vs. eine verlangsamte Entwicklungskinetik von IVP-Embryonen, 3) in kryokonservierten vs. nicht-kryokonservierten IVP-Embryonen 4) durch das Slow Freezing vs. der Vitrifikation, unterscheidet. Das bioenergetische Profil basiert auf dem Gesamtsauerstoffverbrauch von Embryonen und wurde mittels extrazellularer FLUX Analyse (Seahorse XFp, Agilent) an Rinderembryonen erfasst. Durch die Anwendung des XF-Cell Mito Stress Test (Agilent) wurden die einzelnen Parameter des bioenergetischen Profils bestimmt. Dazu gehören der nicht-mitochondrialen- und der mitochondriale-, der ATP-gebundene- sowie Proton Leak-bezogene Sauerstoffverbrauch. Weiterhin wird der maximale Sauerstoffverbrauch gemessen und sowohl die Effizienz der Energieerzeugung als auch mitochondriale Reservekapazität berechnet. Die ermittelten Ergebnisse zeigten, dass entwicklungskompetente IVP-Embryonen ein vergleichbares bioenergetisches Profil aufwiesen wie In-vivo erzeugte Embryonen. Dagegen führte eine verlangsamte Entwicklungskinetik, assoziiert mit einer geringeren Entwicklungskompetenz zu einem reduzierten ATP-gebundenen Sauerstoffverbrauch und erhöhten Proton Leak-bezogenen Sauerstoffverbrauch, resultierend in einer ineffizienten Energieerzeugung. Zudem war die mitochondriale Reservekapazität deutlich reduziert. Eine Kryokonservierung führte zu einer Reduktion des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der mitochondrialen Reservekapazität. Das Slow Freezing Verfahren erhöhte zudem den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine verlangsamte Entwicklungskinetik von IVP-Embryonen als auch die Kryokonservierung zu einem veränderten bioenergetischen Profil führen. Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen der Funktionalität des Mitochondrien Pools im Rinderembryo und der embryonalen Vitalität festgestellt werden. Zukünftig kann das bioenergetische Profil, als Werkzeug in der embryonalen Grundlagenforschung dienen, um die IVP zu verbessern, wovon letztendlich auch die Rinderzucht in der Praxis profitieren kann.

A persistent theme in the in vitro production (IVP) of bovine embryos is an impaired developmental competence, which is evidenced by reduced cryosensitivity and lower implantation rates. It correlates with altered embryonic characteristics, including the energy metabolism. Effects of IVP and cryopreservation on mitochondrial functionality for energy production are currently not fully understood but would help to clarify the factors influencing embryonic viability in the future. Consequently, it was hypothesised in this study that mitochondrial functionality for energy production correlates with embryonic viability. To this end the bioenergetic profile, which depicts mitochondrial functionality, was determined in bovine embryos of various developmental competences. It was clarified to which extent the bioenergetic profiles differ 1) in IVP embryos compared to in vivo generated embryos, 2) due to faster vs. slower developmental kinetics of IVP embryos, 3) in cryopreserved compared to to non-cryopreserved IVP embryos and 4) due to slow freezing vs. vitrification. The bioenergetic profile is based on the total oxygen consumption of embryos and was determined using the extracellular FLUX analysis (Seahorse XFp, Agilent) on bovine embryo groups. The individual parameters of the bioenergetic profile were measured by using the XF Cell-Mito Stress Test (Agilent). These include non-mitochondrial- and mitochondrial oxygen consumption, ATP-linked respiration and proton leakage related oxygen consumption. Additionally the determined efficiency of energy production, as well as the maximal mitochondrial respiration and the calculated spare capacity. The results showed that more developmentally competent IVP embryos had a comparable bioenergetic profile than embryos generated in vivo. However, developmental kinetics had a significant influence on the bioenergetic profile. Slowed morphokinetics, associated with lower developmental competence, led to reduced ATP-linked respiration and increased proton leakage related oxygen consumption, resulting in inefficient energy production. In addition the spare capacity was significantly reduced. Cryopreservation led to a reduction in mitochondrial respiration and spare capacity, while slow freezing additionally led to increased non-mitochondrial respiration. In summary, slowed developmental kinetics of IVP embryos as well as cryopreservation led to an altered bioenergetic profile characterised by reduced mitochondrial energy production and spare capacity, which correlates with reduced embryonic viability. A connection between the functionality of the embryonic mitochondrial pool and embryonic viability could be established via the bioenergetic profile. In the future, the bioenergetic profile could be used as a tool in basic research on embryonic viability to improve IVP and proving to be beneficial for cattle breeding.