Novel Interactions of SYNPO2 in Skeletal and Smooth Muscles

Abstract

Synaptopodin-2 (SYNPO2), a multiadapter protein from the synaptopodin family highly abundant in mammalian muscle cells, associates with Z-discs and dense bodies in skeletal and smooth muscle cells. It is involved in processes responsible for signaling, maintenance, and protein homeostasis. SYNPO2 interacts with a variety of proteins, including F-actin, alpha-actinin, filamin C, BAG3 and VPS18 of which the latter two link SYNPO2 to the CASA machinery and membrane vesicle trafficking. <br /> In this work, the transcriptional coactivators YAP1 and TAZ were identified as novel interaction partners for two distinct structural elements of SYNPO2, its PDZ domain and its PPPY motif. Biochemical experiments were conducted to investigate the relationship between SYNPO2, YAP1/TAZ, and BAG3. These results demonstrate that SYNPO2 can act as a platform to constitute a ternary complex with BAG3 and YAP1/TAZ. Both, YAP1 and TAZ were found to independently bind to the PDZ domain and the PPPY motif of SYNPO2. Additional assays reveal YAP1 and TAZ to compete with BAG3 for binding to the PPPY motif, as BAG3 can displace YAP1 and TAZ. <br /> Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays demonstrate that SYNPO2-YAP1 complexes localize to Z-discs and dense bodies in skeletal and smooth muscle cells, respectively. Furthermore, peptide binding assays and co-immunoprecipitations (co-IPs) performed in this thesis revealed that SYNPO2 phosphorylation near its PPPY motif not only affected a molecular switch of BAG3 to replace YAP1 at this site, but also indicated an impaired to abolished SYNPO2 targeting to the actin cytoskeleton in both, skeletal and smooth muscle cells. In addition, fluorescence microscopic analyses quantifying the fraction of nuclear YAP1 in skeletal muscle cells suggest the regulation of YAP1 activity to be mediated by overexpressing BAG3, but not SYNPO2. It is speculated that SYNPO2 may stabilize YAP1/TAZ in the cytoplasm along the Hippo signaling core axis, whereas may BAG3 promote their activation. Taken together, these findings provide new insights into a potential regulatory role of SYNPO2 for the Hippo signaling pathway proteins YAP1/TAZ and linking them to BAG3-mediated autophagy in skeletal muscle cells.

Synaptopodin-2 (SYNPO2), ein Multiadapterprotein der Synaptopodin-Familie, das mit Z-Scheiben in Skelettmuskeln und dense bodies in glatten Muskeln assoziiert. Es ist unter anderem für die Signalübertragung, die Erhaltung und die Proteinhomöostase der Skelettmuskulatur verantwortlich. SYNPO2 interagiert als Multiadapterprotein mit einer Vielzahl von Proteinen, darunter F-Actin, alpha-Actinin, Filamin C, BAG3 und VPS18, von denen die letzten beiden SYNPO2 mit dem CASA-Komplex und der Membran-Vesikel-Transportmaschinerie verbinden. In dieser Arbeit wurden die Transkriptionskofaktoren YAP1 und TAZ als neue Interaktionspartner zweier Bindestellen von SYNPO2, die PDZ-Domäne und das PPPY-Motiv, identifiziert. Durch proteinbiochemische Experimente wurden Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen SYNPO2, YAP1/TAZ und BAG3 untersucht. Diese zeigten, dass SYNPO2 als Plattform für die Bildung eines ternären Komplexes mit BAG3 und YAP1 bzw. TAZ dient. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass YAP1 und TAZ unabhängig voneinander an die PDZ-Domäne und das PPPY-Motiv von SYNPO2 binden können. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass YAP1 und TAZ mit BAG3 um die Bindung an das PPPY-Motiv konkurrieren und BAG3 sowohl YAP1 als auch TAZ verdrängen kann. Durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsexperimente (BiFC) wurde veranschaulicht, dass SYNPO2-YAP1-Komplexe in Z-Scheiben in Skelett- bzw. dense bodies in Glattmuskelzellen lokalisiert sind. Peptidinteraktionsassays und Co-Immunpräzipitationen in dieser Arbeit zeigten, dass SYNPO2-Phosphorylierungen nahe dem PPPY-Motiv nicht nur einen Austausch von YAP1 durch BAG3 an dieser Bindestelle verhindern, sondern auch Lokalisation von SYNPO2 mit dem Actinzytoskelett in Skelett- und Glattmuskelzellen beeinträchtigen können. Weitere mikroskopische Experimente zur Bestimmung des Anteils an aktivem, nukleärem YAP1 in Skelettmuskelzellen deuteten darauf hin, dass eine Regulierung der YAP1-Aktivität durch die Überexpression von BAG3, nicht aber von SYNPO2 vermittelt wird. Dadurch wurde vermutet, dass SYNPO2 die Hippo-Signalwegeffektoren YAP1/TAZ im Zytoplasma stabilisieren könnte, während BAG3 diese aktiviert. Zusammenfassend vermitteln die Ergebnisse dieser Arbeit einen neuen Einblick in eine potentiell regulatorisches, SYNPO2-vermitteltes Zusammenspiel von Hippo-Signalwegeffektoren YAP1/TAZ und deren Assoziierung mit BAG3-vermittelter Autophagie durch die CASA-Maschinerie in Skelettmuskelzellen.