Genetische Optimierung menschlicher Darmbakterien zur biotechnologischen Succinat-Produktion und deren Rolle bei der Nitrosierung von Medikamenten

Abstract

Als einer der häufigsten Vertreter der menschlichen Darmmikrobiota ist Phocaeicola vulgatus aufgrund seiner natürlichen Bildung von Succinat als Stoffwechselendprodukt in den letzten Jahren in den Fokus der biobasierten, biotechnologischen Succinat-Produktion gerückt. Aufbauend auf einer zuvor generierten Dreifach-Deletionsmutante (<em>P. vulgatus</em> 3xKO), welche ausschließlich Succinat und Acetat produziert, wurde der Stamm in dieser Arbeit weiter in Richtung Succinat-Produktion optimiert. Versuche zur Deletion der im fermentativen Ast beteiligten Gene deuteten auf eine unverzichtbare Rolle der Acetat-Produktion in dem Organismus hin. Ein daraufhin, auf dem genomintegrativen Vektor pMM656 basierendes, entwickeltes Regulationssystems erlaubte die zuvor letale Deletion des für die Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreductase kodierenden Gens <em>bvu_3787</em>. Über eine plasmidkodierte Kopie und einen stromaufwärts liegenden, über Rhamnose induzierbaren Promotor konnte zudem die Transkriptmenge von <em>bvu_3787</em> reguliert werden. Ein weiterer Ansatz zur Optimierung der Succinat-Produktion in <em>P. vulgatus</em> war die Steigerung der Generierung von Reduktionsäquivalenten, welche im Rahmen der Fumarat-Atmung und somit der Succinat-Bildung essenziell sind. Hierfür wurden die Enzyme Transketolase und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase des Pentosephosphatwegs mit Hilfe des <em>shuttle</em> Vektor pG106 in <em>P. vulgatus</em> 3xKO homolog überproduziert. Dies erlaubte eine Steigerung der Succinat-Produktion um 35 % bzw. 45 % und, im zweiten Falle, zusätzlich ein optimiertes Succinat:Acetat Endprodukt-Verhältnis im Stoffwechsel des Organismus. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Übertragung der für <em>P. vulgatus</em> optimierten genetischen Werkzeuge in weitere Spezies der Familie Bacteroidaceae untersucht. In diesem Zuge wurde <em>B. xylanisolvens</em> als vielversprechender Kandidat zur biobasierten, biotechnologischen Succinat-Produktion identifiziert. Neben der Verstoffwechslung von Xylanen verschiedener Herkunft konnte auch die Funktionalität des genomintegrativen Vektors pMM656 nachgewiesen werden. Zudem erlaubte die Deletion der für die Methyl-Malonyl-CoA-Mutase kodierenden Gene <em>bxy_12020</em> und <em>bxy_12030</em> den Nachweis der Funktionalität des <em>sacB</em>-Deletionssystems und führte zusätzlich zu einer Steigerung der Succinat-Ausbeute um 50 %. <br/> In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die potenzielle Bildung von N-Nitrosaminen ausgehend von den Medikamente Enalapril, Fluoxetin, Metoprolol, Methylphenidat und Propranolol durch humane Darmbakterien untersucht. Hierzu wurden die elf häufigsten Vertreter der menschlichen Darmflora sowohl einzeln als auch zusammen in einer artifiziellen Darmmikrobiota unter physiologischen Bedingungen mit den Wirkstoffen inkubiert. Entgegen der bisher vorhandenen Literatur gab es keine Hinweise auf eine Beteiligung der Bakterien an der Nitrosierung der untersuchten Medikamente. Erste Beobachtungen deuten hingegen auf einen möglichen Abbau der Nitroso-Verbindungen durch Escherichia coli hin.