Entwicklung von selektiv exprimierbaren RNA (seRNA) Molekülen und Optimierung derselben für medizinische Anwendungen

Abstract

In weiten Bereichen ist die Behandlung von Krebs noch immer mit großen Nebenwirkungen verbunden. Daher wird an gezielteren, weniger invasiven Therapiemethoden gearbeitet. Durch den erfolgreichen Einsatz von RNA bei der SARS-CoV-2 Impfung, wird großer Aufwand betrieben, RNA auch für Krebstherapien zu nutzen. Allerdings zögen einfache mRNAs als Therapeutikum bei der Behandlung von Krebs massive Nebenwirkungen nach sich, da sie nicht nur in Krebszellen, sondern auch in gesunden Zellen aktiv sind. Daher wurde in dieser Arbeit eine neuartige, selektiv exprimierbare RNA (seRNA) entwickelt. Diese setzt sich modular zusammen aus verschiedenen bereits bekannten RNA lementen, die in der neuen Kombination eine erweiterte Funktionalität entwickeln. seRNAs beinhalten alle Elemente einer natürlichen mRNA, mit einigen zusätzlichen Modulen. Durch diese Module wird die Translation der seRNA unterdrückt. Stattdessen erfolgt die Translation über eine interne Ribosomenbindestelle (IRES), die durch Interaktion mit einem IRES-Blocker ebenfalls im Volllängen-RNA Molekül inhibiert wird. Werden nun seRNA Konstrukte in Zellen übertragen, verbleiben diese in gesunden Nicht-Zielzellen vollständig inaktiv. In Zielzellen wie Tumorzellen dagegen erfolgt eine Interaktion der seRNA über eine eingebaute Antisense-Sequenz mit einer zuvor definierten, Zielzell-spezifischen RNA. Diese Interaktion resultiert in einer dsRNA die effizient erkannt wird und einen partiellen Abbau der seRNA induziert. Die IRES innerhalb des verbleibenden Teils der seRNA wird aktiviert und zelltypspezifisch in die Lage versetzt, die kodierende Sequenz, beispielsweise ein therapeutisch aktives Protein, zu exprimieren. <br/> In dieser Arbeit wurde der zugrundeliegende Aktivierungsmechanismus der seRNA experimentell nachgewiesen und die Funktionalität seRNA-kodierender Plasmide zunächst <em>in vitro</em> demonstriert. Durch Analysen der RNA Sekundärstruktur konnte dabei die spezifische Interaktion zwischen IRES-Blocker und IRES nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Wirksamkeit in einem <em>in vivo</em> Glioblastom Modell untersucht, wobei bereits durch einmalige Behandlung mit seRNA kodierenden Plasmiden eine Tumorremission von über 60% beobachtet werden konnte. Aufgrund insgesamt niedriger IRES-abhängiger Expressionsraten von seRNAs wurde anschließend die Transkription von seRNA kodierenden Plasmiden weiter analysiert und optimiert. Neben der Übertragung mittels Lipidnanopartikeln konnte ich in dieser Arbeit nachweisen, dass auch AAVs als virales Genübertragungsvehikel genutzt werden können, um seRNA Sequenzen zu übertragen. Hierbei bleibt die selektive Expression in Zielzellen unabhängig der eingesetzten Menge an AAVs erhalten. Da sowohl Plasmid- als auch AAV-kodierte seRNAs in der medizinischen Anwendung mit massiven Nachteilen verbunden sind, wurde durch mich die Technologie auch auf Ebene <em>in vitro</em> transkribierter seRNAs (IVT-seRNA) etabliert. Ihre Wirksamkeit konnte <em>in vitro</em> eindrucksvoll in verschiedenen Co-Kulturmodellen demonstriert werden. Weitere Optimierung der IVT-seRNA gelang durch Anwendung von translational inaktiven 5‘-Cap Strukturen und terminalen Hairpin Strukturen, die die Stabilität und Effektivität weiter erhöhen. Final konnte auch die Wirksamkeit von IVT-seRNA in einem primären Leberkrebs-Mausmodell nachgewiesen werden. <br/> Diese Arbeit beschreibt damit die grundlegende Entwicklung, Funktionalitätsanalyse und Wirksamkeit der seRNA Expressionsplattform.