Effect of the combined application of copper-tolerant <em>Trichoderma</em> spp. and chitosan for sustainable control of fungal grapevine diseases

Abstract

The ongoing challenge for viticulture is to effectively and sustainably combat diseases like downy mildew and Esca trunk disease. In organic viticulture, the use of copper-based fungicides to control downy mildew is of crucial importance. However, this practice is increasingly criticized due to its ecotoxicological consequences. Furthermore, there is an absence of effective alternatives for the control of Esca pathogens. The development of novel plant protection strategies that incorporate eco-friendly combinations of agents to combat economically relevant pathogens is therefore urgently needed. <br/> The present study aims to develop a sustainable plant protection tool based on a synergistic combination of <em>Trichoderma</em>, chitosan and the application of a reduced copper rate for the control of Plasmopara viticola and the Esca pathogens <em>Phaeomoniella chlamydospora</em>, <em>Fomitiporia mediterranea</em> and <em>Phaeoacremonium minimum</em>. This tool is intended to reduce the need for copper fungicides. Therefore, <em>Trichoderma</em> species isolated from grapevine wood were characterized and tested for copper tolerance. A high degree of compatibility to copper hydroxide was demonstrated. High copper tolerance was particularly shown and increased for <em>T. koningiopsis</em> and <em>T. harzianum</em>. The copper-tolerant <em>Trichoderma</em> isolates were also found to demonstrate a high tolerance to chitosan, confirming the compatibility of <em>Trichoderma</em> with chitosan. To provide a detailed description of the agents' effect against <em>P. viticola</em>, the effect of <em>T. koningiopsis</em>, chitosan, and a reduced copper rate was tested on the upper and lower sides of grapevine leaves inoculated with the pathogen. Both a direct and an indirect effect against downy mildew have been demonstrated. Furthermore, microscopic analysis revealed the successful establishment of <em>T. koningiopsis</em> and uniform distribution of chitosan on the grapevine leaves. The indirect effect of the complex was verified for different grapevine cultivars in greenhouse experiments. The present work demonstrated increased pathogen-related gene expression after the simultaneous application of the agents. An increased accumulation of reactive oxygen species was observed in resistant grapevine cultivars following treatment. Furthermore, the agents reduced the number of haustoria, key structures of <em>P. viticola</em>. Ensuring the efficacy of the synergistic tool in counteracting Esca pathogens required establishing <em>Trichoderma</em> in the grapevine. Grapevine wood colonization capacity was confirmed for all tested <em>Trichoderma</em> isolates. Moreover, the direct effect of <em>Trichoderma</em> candidates in confrontation tests against Esca pathogens, as well as the indirect effect through released volatile organic compounds, were investigated. A high direct effect on the mycelial growth of <em>P. chlamydospora</em> was observed, while an indirect effect on the growth of <em>P. minimums</em> could be demonstrated. In addition, the combined field application of tolerant <em>T. koningiopsis</em>, chitosan and a reduced copper rate against <em>P. chlamydospora</em> resulted in a reduction in pathogen disease severity of infected shoots. <br/> This work shows the potential of a sustainable plant protection tool for controlling relevant grapevine diseases and simultaneously contributes to the reduction of ecotoxic copper fungicides in viticulture.

Die effektive und nachhaltige Bekämpfung von Krankheiten wie Falscher Mehltau und die Esca-Holzkrankheit stellt eine kontinuierliche Herausforderung für den Weinbau dar. Im ökologischen Weinbau ist der Einsatz von Kupferfungiziden zur Kontrolle des Falschen Mehltaus unerlässlich, wird aber aufgrund ökotoxikologischer Bedenken zunehmend kritisiert. Darüber hinaus mangelt es an effektiven Alternativen zur Bekämpfung von Esca-Pathogenen. Daher ist die Entwicklung neuartiger Pflanzenschutzstrategien, welche umweltfreundliche Wirkstoffkombinationen zur Bekämpfung wirtschaftlich relevanter Pathogene beinhalten, dringend erforderlich. <br/> Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer nachhaltigen Pflanzenschutzstrategie, welche auf einer synergistischen Kombination aus <em>Trichoderma</em>, Chitosan und dem Einsatz eines reduzierten Kupferaufwands zur Bekämpfung von <em>Plasmopara viticola</em> und den Esca-Pathogenen <em>Phaeomoniella chlamydospora</em>, <em>Fomitiporia mediterranea</em> und <em>Phaeoacremonium minimum</em> beruht. Das Ziel dieses Tools besteht darin, den Einsatz Kupferfungizide zu reduzieren. Zu diesem Zweck wurden aus Rebholz isolierte <em>Trichoderma</em>-Arten charakterisiert und hinsichtlich ihrer Kupfertoleranz untersucht. Es wurde eine hohe Verträglichkeit gegenüber Kupferhydroxid nachgewiesen. Hierbei zeigten insbesondere <em>T. koningiopsisa</em> und <em>T. harzianum</em> eine hohe Kupfertoleranz, welche im Folgenden weiter gesteigert werden konnte. Für das kupfertolerante <em>Trichoderma</em>-Isolat <em>T. koningiopsisa</em> wurde zudem eine hohe Chitosantoleranz nachgewiesen, sodass ebenfalls die Kompatibilität von <em>Trichoderma</em> mit Chitosan sichergestellt wurde. Um die Wirkung der Agentien gegen <em>P. viticola</em> näher zu beschreiben, wurde der Effekt von <em>T. koningiopsisa</em>, Chitosan und einem reduzierten Kupferaufwand auf erregerinokulierten Weinblattober- und -unterseiten getestet. Es wurde sowohl eine direkte als auch eine indirekte Wirkungsweise gegen den Falschen Mehltau demonstriert. Darüber hinaus belegten mikroskopische Analysen die erfolgreiche Etablierung von <em>T. koningiopsisa</em> sowie eine gleichmäßige Verteilung von Chitosan auf den Rebblättern. Der indirekte Effekt des Wirkkomplexes konnte für unterschiedliche Rebsorten in Gewächshausuntersuchungen verifiziert werden. Hierbei zeigten die durchgeführten Untersuchungen eine gesteigerte pathogenbezogene Genexpression nach gleichzeitiger Applikation der Agentien. Bei resistenten Rebsorten wurde nach Behandlung eine erhöhte Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies beobachtet. Des Weiteren konnte durch die Applikation der Agentien die Anzahl an Haustorien, Schlüsselstrukturen von <em>P. viticola</em>, reduziert werden. Um die Wirksamkeit des synergistischen Pflanzenschutztools bei der Bekämpfung von Esca-Pathogenen zu gewährleisten, musste eine Etablierung von <em>Trichoderma</em> in der Weinrebe sichergestellt werden. Für alle getesteten <em>Trichoderma</em>-Isolate wurde die Fähigkeit zur Besiedlung von Rebholz bestätigt. Außerdem wurde die direkte Wirkung von <em>Trichoderma</em>-Kandidaten in Konfrontationstests gegen Esca-Erreger und der indirekte Effekt durch freigesetzte flüchtige organische Verbindungen untersucht. Es wurde eine hohe, direkte Wirksamkeit auf das Myzelwachstum von <em>P. chlamydospora</em> beobachtet, während zusätzlich eine indirekte Auswirkung auf das Wachstum von <em>P. minimum</em> nachgewiesen wurde. Darüber hinaus führte die Freilandapplikation einer Kombination aus tolerantem <em>T. koningiopsisa</em>, Chitosan und einem reduzierten Kupferaufwand gegen <em>P. chlamydospora</em> zu einer Verringerung des Pathogenbefalls an infizierten Trieben. <br/> Die vorliegende Arbeit demonstriert das Potential eines nachhaltigen Pflanzenschutztools zur Kontrolle bedeutender Rebkrankheiten und leistet zeitgleich einen Beitrag zur Reduzierung ökotoxikologisch bedenklicher Kupferfungizide im Weinbau.