Müller, Andrea Gotelind: Deletion des Arfrp1-Gens in der Maus : Herstellung und Charakterisierung von Arfrp1-Null-Mutanten. - Bonn, 2002. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-00144
@phdthesis{handle:20.500.11811/1792,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-00144,
author = {{Andrea Gotelind Müller}},
title = {Deletion des Arfrp1-Gens in der Maus : Herstellung und Charakterisierung von Arfrp1-Null-Mutanten},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2002,
note = {Zentrales Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die physiologische Funktion von ARFRP1 mit Hilfe einer Arfrp1-Knockout-Maus zu untersuchen. Mäuse, bei denen das Arfrp1-Gen nur auf einem Allel zerstört war, zeigten in ihrer Entwicklung und dem Expressionslevel von ARFRP1 keinen Unterschied zu Wildtyp-Tieren. Im Gegensatz dazu waren Arfrp1-defiziente Mäuse embryonal letal. In-vivo und in-vitro Daten der Arfrp1 -/--Mäuse zeigten, dass Blastozysten gebildet und in den Uterus implantiert werden und sich bis zum Stadium des Eizylinders (embryonaler Entwicklungstag E6,5) entwickeln. Mit Hilfe histologischer Untersuchungen in Kombination mit einem immunchemischen Nachweis apoptotischer Zellen (TUNEL-Reaktion) wurde eine Störung in der Gastrulation (Keimblattentwicklung) beobachtet. Zellen des embryonalen Ektoderms (Epiblasten), die im Primitivstreifen normalerweise zu Mesoderm differenzieren, waren im Arfrp1-/--Embryo apoptotisch und wurden in die Amnionhöhle abgestoßen. An der Umwandlung der Epiblasten zu Mesenchymzellen, die schließlich das Mesoderm bilden, sind verschiedene Prozesse wie Zell-Adhäsion, Reorganisation des Zytoskeletts und die Polarisation von Zellen beteiligt. Die Letalität der Arfrp1-/--Embryos könnte in dem Defekt eines dieser Prozesse begründet sein. Extraembryonale Strukturen der Deletionsmutante entwickeln sich normal und sind zu einer späteren Phase wahrscheinlich als Konsequenz des primären Defekts beschädigt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der genomischen Organisation von Arfrp1 und die Untersuchung seines Promotors. Das Arfrp1-Gen besitzt eine Größe von ca. 6 kb und ist aus acht Exons (mit sieben Introns) aufgebaut. Der Transkriptionsstart wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und der Identifizierung eines EST’s ermittelt. Die Sequenz des aus einer l-Phagenbank isolierten genomischen Klons von Arfrp1 endet im Exon 8. Das putative Ende des Gens wurde ebenfalls durch Datenbankrecherchen und die Identifizierung von EST’s, die das Polyadenylierungssignal enthalten, bestimmt.
Die genomische Organisation von Arfrp1 unterscheidet sich von der anderer Mitglieder der ARF-Familie, so dass vermutet wurde, dass sich die Entwicklung des Arfrp1-Gens während der Evolution früh von der anderer Arf- und Arf-like-Gene getrennt hat.
Im 5’-flankierenden Bereich des Arfrp1-Gens wurden mit Hilfe von Reportergen-Assays und EMSA (Electro-Mobility-Shift-Assay) zwei Bereiche identifiziert (–58 bis –54 und –35 bis –31), die essentiell für die Promotoraktivität sind. Da diese Regionen exakt den Bindungssequenzen der Transkriptionsfaktoren cRel und cEts1 entsprechen, wurde angenommen, dass diese die Expression von ARFRP1 regulieren. Weitere EMSA zeigten außerdem, dass beide ermittelten DNA-Bereiche an dieselben Kernproteine binden. Daher wird vermutet, dass die Transkription von Arfrp1 entweder von cRel, cEts1, einem Heterodimer, oder einem bislang unbekannten Faktor reguliert wird.},

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