Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalisierter DNA

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zahlreiche Nukleosidtriphosphate synthetisiert, die mit zusätzlichen funktionellen Gruppen versehen sind. Diese wurden als Ersatz für natürliche dNTPs enzymatisch in DNA eingebaut, um so eine hochgradig funktionalisierte DNA (fDNA) zu generieren. Weiterhin wurden alle notwendigen Methoden etabliert, um auf Basis von fDNA <i>in vitro</i>-Selektionen funktionaler Nukleinsäuren durchführen zu können. <br /> Nachdem der Versuch scheiterte, verschiedene 8-modifizierte dATP-Derivate als Substrat für die PCR zu verwenden, wurden fünf 7-modifizierte <i>N</i>-7-Deaza-2'-desoxyadenosintri­phosphate sowie ein 7-modifiziertes <i>N</i>-7-Deaza-2'-desoxyguanosin­triphosphat hergestellt. Während das Adenosinderivat <b>40</b> von der DNA-Polymerase aus <i>Thermus thermophilus</i> (<i>Tth</i>) gut eingebaut und sogar der gleichzeitige Austausch von TTP mit Verbindung <b>50</b> realisiert werden konnte, war das Guanosinderivat <b>47</b> nur mit mäßigem Erfolg zu verwenden. <br /> In einem alternativen Ansatz wurde die fDNA durch templatgesteuerte Primer-Verlängerung 7-modifizierter <i>N</i>-7-Deazapurine und <i>C</i>-5-modifizierter Pyrimidine generiert. Dazu wurden einige kommerziell erhältliche DNA-Polymerasen getestet, zunächst an einem einfachen Modelltemplat, später an ausgesuchten Templaten mit anspruchsvollen Sequenzmotiven und an einem teilweise randomisierten Templat. Mit der Vent_R^® (exo-) DNA-Polymerase wurde ein Enzym identifiziert, das nicht nur alle Nukleotide, sondern auch an allen Templaten mit guter Ausbeute die entsprechende fDNA generieren kann. <br /> Anschließend wurden DNA-Polymerasen auf ihre Fähigkeit getestet, fDNA als Templat für eine PCR mit natürlichen dNTPs zu verwenden. Die DNA-Polymerase aus dem hyperthermophilen Organismus <i>Pyrococcus woesei</i> (<i>Pwo</i>) war schließlich nach Optimierung der Reaktions-Parameter in der Lage, fDNA in DNA zu retransformieren und zu amplifizieren. Der gesamte Prozess aus Generierung und Amplifikation lief sequenzspezifisch, wie durch Sequenzierung der PCR-Produkte nachgewiesen werden konnte. <br /> Abschließend wurde versucht, mit Hilfe von Kraftfeldrechnungen das unterschiedliche Einbauverhalten der 8- und 7-modifizierten Adenosinderivate zu erklären. Es ließen sich konformative Unterschiede der Nukleotide nachweisen, doch konnte dies die dramatischen Unterschiede bezüglich des enzymatischen Einbaus nur bedingt erklären. Weitere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass der Hauptgrund für dieses Verhalten in der Verwendung des Alkinlinkers an Position <i>C</i>-8 liegt, da das entsprechend modifizierte Nukleotid in dem aktiven Zentrum des Enzyms nicht mehr die für den Einbau notwendige Konformation einnehmen kann.