Identifizierung, Klonierung und heterologe Expression eines Terpensynthasegens aus <i>Marrubium vulgare</i> L.

Abstract

Terpene gehören zu einer der größten und vielseitigsten Familien der Naturstoffprodukte. Neben wenigen Primärmetaboliten sind in dieser Familie hauptsächlich Sekundärmetaboliten, die größtenteils an Interaktionen zwischen der Pflanze und ihrer Umwelt beteiligt sind, zu finden [HARBORNE 1991]. <i>M. vulgare</i> L. ist eine Pflanze aus der Familie der Lamiaceae. In dieser Familie kommen sehr häufig ätherische Öle vor, die vor allem reich an meist flüchtigen Mono- und Sesquiterpenen sind. Im Unterschied zu den meisten Mitgliedern ihrer Pflanzenfamilie besitzt <i>M. vulgare</i> L. als Haupt-Terpenkomponente das nichtflüchtige und durch seinen Furanring leicht zu detektierende Furanolabdan-Diterpen Marrubiin. Diese Pflanze wurde daher als Modellsystem ausgewählt, um Untersuchungen des Biosyntheseweges von Diterpenen und den Vergleich des Terpenstoffwechsels und seiner Regulation in differenzierten und undifferenzierten Systemen durchzuführen. Es lagen bereits biochemische Arbeiten an Terpenkomponenten in <i>M. vulgare</i> L. vor [KNÖß; 1996; GORMANN 1994, WILHELM 1993]. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Enzyme, die für die Biosynthese von Terpenen verantwortlich sind, die Terpensynthasen, untersucht werden. <br /> Es wurde genomische DNA in einer Größe von 3,9 kb isoliert. Diese hat hohe Ähnlichkeit und Identität mit anderen bereits charakterisierten pflanzlichen Terpensynthasen, vorrangig mit Sesquiterpensynthasen aus Angiospermen. Aus der genomischen Sequenz der DNA wurden auf der Basis der starken Konservierung der Intron-Exon-Struktur der pflanzlichen Terpensynthasen [MAU & WEST 1994, BACK & CHAPPELL 1995, BOHLMANN ET AL. 1998 (A)] im Vergleich mit cDNA-Sequenzen bereits charakterisierter Synthasen Exonbereiche festgelegt. Aus diesen Exonbereichen wurden Primer für RT-PCR und RACE-PCR abgeleitet. Mit dieser Methode gelang es, die vollständige cDNA einer putativen Terpensynthase zu amplifizieren. Innerhalb der isolierten cDNA-Sequenz mit der exakten Länge von 1907 bp (1879 bp ohne PolyA⁺-Anhang)</nobr> wurde ein 1641 bp großer offener Leserahmen (ORF) identifiziert. Das coomassie-blue gefärbte SDS-PAGE einer heterologen Expression des einklonierten ORF (für 546 AS codierend) zeigt im Vergleich mit dem nicht induzierten Rohextrakt deutlich eine überexprimierte Bande bei ca. 62 kDa. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität mit den radioaktiv markierten Substraten [1-³H]GPP,</nobr>[1-³H]FPP</nobr> oder [1-³H]GGPP</nobr> per Radio-GC</nobr> ergab mehrere Produkte besonders mit FPP (Substrat für Sesquiterpene). GPP (Substrat für Monoterpene) wurde in geringeren Mengen auch umgesetzt, GGPP (Substrat für Diterpene) dagegen überhaupt nicht. GC-MS-Analysen im Anschluss zeigten, dass das Hauptprodukt der isolierten Terpensynthase Selinen-artige Struktur besitzt. Dies ist die erste Isolierung und Charakterisierung einer Terpensynthase aus <i>Marrubium vulgare</i> L.