Interaktion allosterischer Modulatoren mit dem Agonisten [³H]Oxotremorin M und dem Antagonisten [³H]<i>N</i>-Methylscopolamin</nobr> an muskarinischen M₂-Rezeptoren</nobr>

Abstract

Muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren vom Subtyp M₂ weisen neben der orthosterischen Bindungsstelle, an die der physiologische Ligand Acetylcholin bindet, eine zweite in extrazellulären Domänen des Rezeptorproteins lokalisierte allosterische Bindungsstelle auf. Die Effekte, die Testsubstanzen über diese allosterische Bindungsstelle auf die Bindung des orthosterischen Antagonisten [³H]<i>N</i>-Methyl-scopolamin ([³H]NMS) ausüben, sind vielfach beschrieben. Mit Hilfe von Kombinationsexperimenten mit zwei allosterischen Modulatoren konnte für eine Reihe strukturverschiedener Substanzen eine Interaktion an ein und derselben Bindungsstelle gezeigt werden. Diese wurde als "gemeinsame allosterische Bindungsstelle" bezeichnet. Erste Befunde zur Beeinflussbarkeit der Agonist-Bindung (z. B. [³H]Oxotremorin M ([³H]OxoM)) durch solche allosterische Modulatoren ließen es fraglich erscheinen, dass die "gemeinsame allosterische Bindungsstelle" an Agonist-besetzten Rezeptoren noch zur Bindung der Modulatoren zur Verfügung steht. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden die als Liganden der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" bekannten Modulatoren W84, Gallamin, Obidoxim und WDuo 3 eingesetzt. Für jede dieser Testsubstanzen wurde die Interaktion mit dem [³H]OxoM-besetzten und dem [³H]NMS-besetzten Rezeptor sowie mit dem freien Rezeptor betrachtet. Darüber hinaus wurden verkürzte Derivate des W84 als Sonden verwendet, um die Ausprägung der allosterischen Bindungsstelle am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor genauer zu erfassen. Alle Experimente wurden in einem Na,K,P_i-Puffer bei 23°C an M₂-Rezeptoren in Membransuspensionen aus Hausschwein-Herzventrikeln durchgeführt. <br /> Die hier mit [³H]NMS erhobenen Beobachtungen entsprachen in allen Fällen den aus der Literatur bekannten Befunden. Die Affinität der Testsubstanzen zum freien Rezeptor war nicht abhängig vom im Versuchsansatz verwendeten Radioliganden und für alle untersuchten Substanzen mit Ausnahme von WDuo 3 immer größer als die Affinität zum Radioligand-besetzten Rezeptor. Der Vergleich der Haftneigung der Modulatoren zum [³H]OxoM-besetzten oder [³H]NMS-besetzten Rezeptor ergab immer eine geringere Affinität zum [³H]OxoM-besetzten Rezeptor. Im Falle der Modulatoren Gallamin und Obidoxim waren die Unterschiede zwischen [³H]OxoM-besetztem und [³H]NMS-besetztem Rezeptor nicht signifikant. Die verkürzten Derivate des W84, die im ersten Fall einseitig um eine Phthalimid-Gruppe und im zweiten weiterhin um eine Ammonium-Gruppe verkürzt wurden, zeigten ebenfalls eine geringere Affinität zum [³H]OxoM-besetzten Rezeptor als zum [³H]NMS-besetzten Rezeptor. Der Affinitätsunterschied wurde um so kleiner, je stärker die Testsubstanz verkürzt war, da am [³H]NMS-besetzten Rezeptor deutliche Affinitätsverluste mit zunehmender Verkürzung auftraten, während durch die Verkürzung keine Abnahme der Affinität zum [³H]OxoM-besetzten Rezeptor bewirkt wurde. <br /> Die größte Affinität zum [³H]OxoM-besetzten Rezeptor zeigte WDuo 3, daher wurde diese Substanz zur Durchführung von Kombinations-Untersuchungen mit Obidoxim ausgewählt. Durch diese Experimente sollte geprüft werden, ob WDuo 3 am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor mit der "gemeinsamen, allosterischen Bindungsstelle" interagiert. Es konnte eine Abschwächung des WDuo 3-Effektes durch Obidoxim sowohl am [³H]NMS-besetzten als auch am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor beobachtet werden. Für den [³H]NMS-besetzten Rezeptor konnte dieser Effekt gemäß einer Analyse nach Arunlakshana und Schild als kompetitiver Antagonismus zwischen WDuo 3 und Obidoxim bewertet werden. Die Befunde am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor zeigen, dass die Effekte von WDuo 3 auch hier Obidoxim-empfindlich sind. <br /> Abschließend wurden die Interaktion der Modulatoren Duo 3 und TD 2 mit dem [³H]OxoM-besetzten Rezeptor untersucht. Duo 3 ist als atypischer, allosterischer Modulator am [³H]NMS-besetzten Rezeptor bekannt. Die Untersuchungsergebnisse am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor waren schwierig zu deuten, zeigen aber ebenfalls ein atypisches Verhalten an. TD 2 ist ein Derivat des W84, dass als neue Leitstruktur positiv kooperativer Modulatoren betrachtet wird. Diese Testsubstanz, deren quartärer Stickstoff einseitig durch ein Silizium-Atom ersetzt wurde, zeigte keine Effekte am [³H]OxoM-besetzten Rezeptor und beeinflusste die Gleichgewichtsbindung des [³H]OxoM in kompetitiver Weise. <br /> Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Vorstellung einer "gemeinsamen, allosterischen Bindungsstelle" auch für den [³H]OxoM-besetzten Rezeptor anwendbar ist. Allerdings zeigen die Befunde auch, dass Struktur-Wirkungs-Beziehungen allosterischer Modulatoren nicht vom [³H]NMS-besetzten auf den [³H]OxoM-besetzten Rezeptor übertragbar sind. Die Bindung des [³H]OxoM an das Rezeptorprotein führt offenbar zu einer Veränderung der Konformation der allosterischen Bindungsstelle.