Untersuchungen zur Topologie der Interaktion atypischer allosterischer Modulatoren mit dem M₂-Acetylcholin-Rezeptor

Abstract

Die muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren können durch eine Vielzahl strukturell heterogener Substanzen allosterisch moduliert werden. Typische allosterische Modulatoren wie W84 (exan-1,6-bis(dimethyl-3´-phthalimidopropyl-ammonium-bromid)) und WDuo3 (1,3-bis[4(phthalimidomethoxyimino-methyl)-pyridinium-1yl]-propan-dibromid), verzögern die Dissoziation von [³H]N-Methyl-Scopolamin ([³H]NMS), einem orthosterischen Liganden der Muskarin-Rezeptoren, in einer "eins zu eins Reaktion" von Modulator und [³H]NMS besetzten Rezeptor. Die allosterische Modulation des M₂-Rezeptors durch Duo3 (4,4´-bis[(2,6-dichloro-benzyloxy-imino)-methyl]-1,1´-propan-1,3-diyl-bis-pyridinium-dibromid), (-)-Eburnamonin</nobr> und Tacrin (-o-1,2,3,4-tetra-hydroacridin-hydrochlorid) ist aufgrund steiler Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen am [³H]NMS besetzten M₂-Rezeptor atypisch. Für Duo3 wurde aufgrund der Befunde verschiedener experimenteller Ansätze angenommen, dass es an einer von der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" unterschiedlichen Stelle am M₂-Rezeptor interagiert. Der atypische allosterische Wirkcharakter des Tacrin wurde dagegen durch die Vorstellung erklärt, dass zwei Tacrin-Moleküle möglicherweise gleichzeitig an der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" interagieren. Um mehr Einblick in die Möglichkeit einer solchen "zwei zu eins" Interaktion von M₂-Rezeptor und Tacrin zu erhalten, wurde ein neues Tacrin-Dimer mit der Arbeitsbezeichnung EHW21 (,6-bis(amino-1,2,3,4-tetrahydro-acridinyl)-hexan) erstmalig auf seine Fähigkeit, den M₂-Rezeptor allosterisch zu modulieren, untersucht. Die aus Dissoziations-Experimenten mit [³H]NMS erhaltenen Konzentrations-Wirkungs-Kurven von EHW21 weisen eine normale Kurvensteilheit auf, wenn die Untersuchungen an Membransuspensionen aus Herzventrikeln des Hausschweins und aus mit dem humanen M₂-Gen transient transfizierten COS7-Zellen durchgeführt werden. <br /> In der Vergangenheit wurde durch Antagonismus-Studien mit Obidoxim und Magnesium-Ionen nachgewiesen, dass eine Vielzahl typischer Modulatoren an einer "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" des M₂-Rezeptors interagiert. Für atypische Modulatoren waren die Ergebnisse jedoch nicht einheitlich. Um diese Literatur-bekannten Untersuchungen hinsichtlich der Antagonisierbarkeit des Effektes der atypischen allosterischen Modulatoren zu ergänzen, wurde das antagonistische Werkzeug Hexamethonium eingeführt. Der atypische Wirkcharakter von Duo3 und Tacrin sowie Eburnamonin konnte mit dem antagonistischen Werkzeug Hexamethonium bestätigt werden. Die Interaktion von Hexamethonium gegenüber Gallamin, WDuo3 und EHW21 konnte als kompetitiv antagonistisch charakterisiert werden. Der Affinitätsparameter pK_b für Hexamethonium in der Interaktion gegenüber EHW21 am [³H]NMS besetzten M₂-Rezeptor unterschied sich jedoch deutlich vom pK_b-Wert, wie er in der Interaktion von Hexamethonium gegenüber WDuo3 und Gallamin, typischen Modulatoren der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle", erhalten wird. Mit Magnesium-Ionen wurde eine nicht-kompetitive Interaktion gegenüber EHW21 beobachtet. Dieses legt nahe, dass das Tacrin-Dimer EHW21 nicht an der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" interagiert. <br /> Mit Untersuchungen an [³H]NMS besetzten M₂/M₅-chimären Rezeptoren eröffnete sich die Möglichkeit, die Epitopabhängigkeit der M₂-Selektivität atypischer allosterischer Modulatoren zu untersuchen. <br /> Für die typischen allosterischen Modulatoren W84 und Diallylcaracurin V war gefunden worden, dass die M₂-Selektivität am [³H]NMS besetzen Rezeptor vollständig auf die Aminosäuren ¹⁷⁷Tyrosin und ⁴²³Threonin zurückgeführt werden kann (Voigtländer et al., 2003). Hier konnte für WDuo3, wie für einen mit W84 eng verwandten typischen allosterischen Modulator erwartet, erstmalig gezeigt werden, dass seine M₂-Selektivität ebenfalls vollständig von den Aminosäuren ¹⁷⁷Tyrosin und ⁴²³Threonin abhängt. <br /> Die hier gefundene zwar nicht vollständige Abhängigkeit der M₂/M₅-Selektivität des Tacrin von ¹⁷⁷Tyrosin und ⁴²³Threonin, sowie die typische Epitopabhängigkeit der M₂-Selektivität, wie sie auch von W84 gezeigt wird, stützen die in der Literatur zu findende Hypothese, dass Tacrin an der "gemeinsamen allosterischen Bindungsstelle" interagiert und sein atypischer allosterischer Wirkcharakter lediglich durch eine gleichzeitige Interaktion zweier Tacrin-Moleküle an dieser Bindungsstelle des M₂-Rezeptors zustande kommt. <br /> Typische allosterische Modulatoren weisen am chimären humanen Rezeptor CR2 (hM₅ 1-76, hM₂ 70-155, hM₅ 163-532) im Vergleich zum M₅-Rezeptor keine erhöhte Affinität auf. Das Tacrin-Dimer EHW21 jedoch hat zu CR2 eine höhere Affinität als zum M₅-Rezeptor. Das stützt die Befunde aus den Antagonismus-Untersuchungen hinsichtlich der Vermutung, dass EHW21 an einer "weiteren allosterischen Bindungsstelle" am M₂-Rezeptor interagiert. <br /> Die atypische allosterische Modulation des M₂-Rezeptors durch Duo3 konnte in verschiedenen experimentellen Ansätzen dieser Arbeit bestätigt werden. Doch vor allem die Abhängigkeit der M₂/M₅-Selektivität von CR1 (hM₂1-69,</nobr> hM₅ 77-532) und CR2 (hM₅ 1-76,hM₂ 70-155, hM₅ 163-532) ergaben Hinweise, dass Duo3 an einer "weiteren allosterischen Bindungsstelle" des M₂-Rezeptors interagiert. <br /> Untersuchungen an verschiedenen Membransuspensionen aus Herzventrikeln des Hausschweins sowie aus COS7- und CHO-Zellen führten zu der Vermutung, dass die an vier Positionen mögliche N-Glykosylierung des extrazellulären Amino-terminalen Endes des M₂-Rezeptors die Interaktion des atypischen allosterischen Modulators Duo3 beeinflusst.