Voigtländer, Uta: Kooperative Interaktionen an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren : Suche nach essentiellen Aminosäuren der allosterischen Bindungsstelle von M2-Rezeptoren. - Bonn, 2003. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-02724
@phdthesis{handle:20.500.11811/1939,
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author = {{Uta Voigtländer}},
title = {Kooperative Interaktionen an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren : Suche nach essentiellen Aminosäuren der allosterischen Bindungsstelle von M2-Rezeptoren},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2003,
note = {Muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren weisen neben der orthosterischen Bindungsstelle eine zweite, allosterische, Bindungsstelle auf. Alle fünf Muskarin-Rezeptor-Subtypen können allosterisch moduliert werden. Interessanterweise zeigen fast alle bekannten allosterischen Modulatoren die höchste Affinität zum M2-Rezeptor-Subtyp und die niedrigste Affinität zum M5-Rezeptor-Subtyp.
Für allosterische Modulatoren vom Alkan-Bisammonium-Typ (zum Beispiel W84 und Dimethyl-W84) und allosterische Liganden  aus der Gruppe der Caracurin V Derivate (darunter Diallylcaracurin V) sind bislang zwei Epitope identifiziert worden, die für die M2/M5-Selektivität an NMS-besetzten Rezeptoren verantwortlich sind: eine einzelne Aminosäure am Beginn der siebenten transmembranären Domäne, M2423Thr (Buller et al., Mol Pharmacol, 61:160-168), und eine Sequenz aus sechs Aminosäuren, M2172-177Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr, im Bereich der zweiten extrazellulären Schleife (Buller, Dissertationsschrift, Math.-Nat. Fakultät, Universität Bonn, 2002) des M2-Rezeptors.
Ziel dieser Arbeit war die Eingrenzung des Epitopes aus sechs Aminosäuren in der zweiten extrazellulären Schleife auf möglichst eine einzelne Aminosäure.
Dazu wurden M2/M5-chimäre Punktmutanten hergestellt und zusammen mit M2- und M5-Wildtyp-Rezeptoren transient in COS 7-Zellen exprimiert. Die Bestimmung der Affinität des jeweiligen allosterischen Modulators zum entsprechenden Wildtyp-Rezeptor bzw. Rezeptormutante erfolgte in kinetischen Bindungsstudien in Form von Dissoziationsexperimenten mit dem orthosterischen Radioliganden [3H]N-Methylscopolamin ([3H]NMS). Der Vorteil dieser Experimente am [3H]NMS-besetzten Rezeptor bestand in ausschließlicher Beobachtung allosterisch vermittelter Effekte. Die konzentrationsabhängigen Effekte des allosterischen Modulators auf die [3H]NMS-Dissoziation spiegelten dessen Besetzung der allosterischen Bindungsstelle und damit dessen Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor wider.
Mithilfe der M2/M5-chimären Punktmutanten konnte M2177Tyrosin als relevante Aminosäure innerhalb der  M2172-177Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Sequenz in der zweiten extrazellulären Schleife identifiziert werden.
Um zu prüfen, ob M2177Tyrosin und M2423Threonin allein die  M2/M5-Selektivität der untersuchten allosterischen Modulatoren bedingen, wurde eine Doppelmutante hergestellt, in der sowohl die bereits als essentiell identifizierte Aminosäure M2423Threonin als auch die gerade identifizierte Aminosäure M2177Tyrosin zu den korrespondierenden Aminosäuren des M5-Rezeptors, His und Gln, mutiert wurden. Durch die Untersuchungen an der Doppelmutante wurde bestätigt, dass M2177Tyrosin  zusammen mit M2423Threonin die M2/M5-Selektivität der untersuchten allosterischen Modulatoren an NMS-besetzten Rezeptoren  vollständig erklärt.
An die Untersuchungen zur Epitopabhängigkeit der allosterischen Modulatoren an NMS-besetzten Rezeptoren schlossen sich Experimente an freien Rezeptoren an.  Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass M2177Tyrosin  im Gegensatz zu M2423Threonin  am freien Rezeptor kaum ein Rolle für die Affinität der allosterischen Modulatoren spielt. Die M2/M5-Selektivität der allosterischen Modulatoren an freien Rezeptoren konnte nicht vollständig durch diese beiden Aminosäuren erklärt werden. Ein zusätzliches, noch unbekanntes Epitop des M2-Rezeptors, das am NMS-besetzten Rezeptor nicht zur Alloster-Bindung beiträgt, ist sehr wahrscheinlich für die Affinität der allosterischen Modulatoren an freien M2-Rezeptoren mit verantwortlich.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/1939}
}

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