Untersuchungen zur Beteiligung Aktin-assoziierter Proteine an intrazellulären Signalwegen

Abstract

In dieser Arbeit wurden zwei Aktin-assoziierte Proteine, WIP und Par-4, durch proteinbiochemische und zellbiologische Methoden untersucht. <br /> Zunächst wurde ausgehend von einer unvollständigen cDNA-Sequenz die komplette cDNA eines neuen Gens aus einer Ratten-cDNA-Bibliothek isoliert und anhand von computerunterstützten Sequenzanalysen als das Ratten-Ortholog des humanen WASP-interagierenden Proteins (WIP) identifiziert. Durch Northern Blot-Analysen konnten sechs verschiedene Spleißformen von WIP detektiert werden. Die Expression des Ratten-WIP in Fibroblasten zeigte, daß das Protein an die Aktin-Filamente des Zytoskeletts bindet. Durch Koimmunpräzipitationsversuche wurde die Interaktion des Ratten-WIP mit N-WASP nachgewiesen. Die Koexpression von WIP und N-WASP in Ratten-Fibroblasten führte interessanterweise zu einer Relokalisation von N-WASP in das Zytoplasma und darüber hinaus zu einer Reorganisation des Aktin-Filamentsystems, wobei die Spannungsfasern zugunsten einer vermehrten Bildung von Filopodien aufgelöst wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß WIP möglicherweise die N-WASP-vermittelte Aktin-Polymerisation unterstützen kann.<br /> Das zweite Aktin-bindende Protein, das in dieser Arbeit untersucht wurde, ist das pro-apoptotische Protein Par-4. Die stabile Expression von Par-4 in CHO-Zellen führte zur Selektion von Zellinien mit partieller Apoptose-Resistenz. Außerdem zeigte sich, daß in 8 von 10 untersuchten Gehirntumorzellinien die Par-4-Expression herunterreguliert war, was ebenfalls zur Apoptose-Resistenz beitragen könnte. Die ektopische Expression von Par 4 führte in diesen Tumorzellinien zur Apoptose, jedoch konnte eine Par-4-vermittelte Inaktivierung der PKC ζ-Signalwege bzw. eine Herunterregulation von Bcl-2 ausgeschlossen werden. Durch Immunfluoreszenz-Analysen und <i>In vitro</i>-Filament-Bindungsversuche wurde gezeigt, daß der N-Terminus von Par-4 die direkte Aktin-Bindung vermittelt, der C-Terminus dagegen für die starke Bindung an das Aktin-Zytoskelett notwendig ist. Durch Deletionsmutanten sowie durch die Zerstörung des Aktin-Zytoskeletts mit Cytochalasin D konnte gezeigt werden, daß die Bindung an Aktin für die Par-4-vermittelte Apoptose wichtig zu sein scheint. Extraktionsversuche mit Triton X-100 haben gezeigt, daß die C-terminale Bindung an Aktin-Filamente von Par-4 pH-sensitiv ist, was möglicherweise auf Konformationsänderungen des C-Terminus zurückzuführen ist. Par-4 könnte daher ein Sensor-Protein darstellen, dessen Interaktion mit seinen Effektorproteinen sowie mit dem Aktin-Zytoskelett durch äußere Bedingungen beeinflußt werden kann.