Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des Transkriptionsfaktors AATF

Abstract

Der Transkriptionsfaktor AATF (<i>Apoptosis Antagonizing Transcription Factor</i>) wurde als Interaktionspartner der Dlk/ZIP-Kinase und der RNA-Polymerase II identifiziert. Zudem interagiert AATF mit dem Retinoblastomaprotein, bewirkt dadurch eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors E2F und ist somit an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt. In dieser Arbeit sollten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System weitere Interaktionspartner von AATF identifiziert werden. Vier Klone, die für potentielle Interaktionspartner kodieren, wurden isoliert. Es handelte sich um Mns1 (<i>Meiosis-specific nuclear structural Protein 1</i>), Pmf-1 (<i>Polyamin-modulated factor-1</i>), TSG101 (<i>Tumor Susceptibility Gene 101</i>) und eine cDNA-Sequenz, die für ein noch nicht charakterisiertes, hypothetisches Protein kodiert und AIP1 (<i>AATF Interacting Protein 1</i>) genannt wurde. Für AIP1 und TSG101 konnte die Interaktion mit AATF <i>in vitro</i> bestätigt werden, für Pmf-1 und Mns1 jedoch nicht. <br /> Mns1 ist ein Mitglied der <i>Intermediate Filament </i>Proteine, dessen Expression auf die Spermatozyten beschränkt ist. Die Expression eines GFP-Fusionsprotein von Mns1 ergab eine Anfärbung von punktförmigen Strukturen im Zytoplasma, deren Identität jedoch nicht geklärt wurde. Die Koexpression von AATF und Mns1 führte zu einer partiellen Kolokalisierung von AATF mit Mns1 im Zytoplasma, was für die Interaktion der beiden Proteine <i>in vivo</i> spricht. <br /> Pmf-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der an der Regulierung des Polyaminstoffwechsels beteiligt ist. Die Expression von Pmf-1 in REF52.2-Zellen zeigte eine diffuse Verteilung des Proteins im Zytoplasma. Die Koexpression von Pmf-1 mit AATF hatte keinen Einfluß auf die subzelluläre Verteilung von Pmf-1 oder AATF, das nach wie vor im Zellkern vorlag, so daß offen bleibt, ob diese beiden Proteine tatsächlich miteinander interagieren. <br /> Das bisher unbekannte AIP1 zählt 153 Aminosäuren und besitzt an seinem N-Terminus eine Region mit hoher Homologie zu der Myo4-Bindungsdomäne von She3p, einem Protein aus der Hefe, das am intrazellulären Transport von mRNA beteiligt ist. Eine Northern Blot Analyse ergab für AIP1 eine ubiquitäre Verteilung, mit einer starken Expression in Gehirn und Hoden. Eine Immunfluoreszenzanalyse zeigte eine diffuse zytoplasmatische Verteilung von GFP-AIP1. Die Expression von AIP verursachte eine partielle Umverteilung von AATF aus dem Zellkern ins Zytoplasma. <br /> Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf der Interaktion von AATF mit TSG101. Die ektopische Expression von TSG101 ergab eine diffuse Verteilung des Proteins über die gesamte Zelle, mit einer deutlichen Anreicherung in den Endosomen. Eine Koexpression mit AATF zeigte jedoch eine partielle Umverteilung von TSG101 in den Zellkern. <br /> Sowohl für AATF als auch für TSG101 wurde eine aktivierende Wirkung auf die Androgenrezeptor-vermittelte Transkription festgestellt. Da TSG101 eine Rolle bei verschiedenen Ubiquitin-abhängigen Prozessen spielt, wurde untersucht, ob auch die verstärkende Wirkung von TSG101 auf den Androgenrezeptor durch einen Einfluß auf die Ubiquitinierung zustande kommt. Dabei wurde gezeigt, daß 1. die Ubiquitinierung des Androgenrezeptors eine Stimulierung der Transkription bewirkt, 2. die Kopplung einer einzigen Ubiquitineinheit ausreichend ist für eine effiziente Aktivierung und 3. daß TSG101 durch die Unterdrückung der Polyubiquitinierung eine Anreicherung an monoubiquitiniertem Androgenrezeptor bewirkt. Man kann postulieren, daß dadurch die transkriptionell aktive Form des Androgenrezeptors geschützt und somit eine effiziente Transaktivierung ermöglicht wird. Diese Daten erweitern die Funktion von TSG101 als Regulator von Ubiquitin-abhängigen Prozessen auf den Vorgang der Transkription und stellen einen neuen Regelmechanismus für die Aktivierung des Androgenrezeptors dar.