Charakterisierung und Funktionsanalyse von Mensch-Connexin31- und Maus-Connexin45-Mutanten und die Wirkung auf ihren Wildtyp

Abstract

In dieser Arbeit sollte anhand der Mutationen von menschlichem Cx31 und Maus Cx45, zum einen die funktionelle Bedeutung der Mutationen, die auf unterschiedlichen Domänen lokalisiert sind, und ihr dominanter Effekt auf die Funktion der Wildtyp-Proteine untersucht werden, und zum anderen der mögliche Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Cx-bedingten Krankheiten hergestellt werden. <br /> Verschiedene Mutationen des Cx31-Gens wurden in der Haut von Patienten mit der Hautkrankheit <em>Erythrokeratodermia variabilis </em>identifiziert. Um den Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Symptomen herzustellen, wurden Mutanten, bei denen Aminosäuren verändert waren, die bei allen Connexinen der ß-Klasse konserviert sind, in die HeLa-Zellen transfiziert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Expression der mutierten hCx31 G12R-Proteine eine Letalität der HeLa-Zellen zufolge hatte (Diestel et al., 2002). Deshalb wurden die mutierte Cx31 G12R- und C86S-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx31-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. In Immunofluoreszenz-Analysen wurde festgestellt, dass sowohl Cx31-WT-, als auch mutierte Cx31-Proteine an den Kontaktmembranen lokalisiert sind. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx31-WT und G12R, bzw. C86S wurde nicht nur erhöhte Durchlässigkeit der Farbstoffe Lucifer Yellow und Neurobiotin, sondern auch ein Transfer der Farbstoffe Ethidiumbromid und Propidiumjodid festgestellt, im Gegensatz zu der HeLa hCx31WT Einfachtransfektante. Dieser dominant positive Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle wurde besonders bei dem Verhältnis 1:0,15-0,3 von Cx31-WT und Mutanten deutlich. Bei den Doppeltransfektanten von HeLa rCx43/G12R wurde festgestellt, dass die Cx43-WT-Proteine teilweise die erhöhte Kopplung der mutierten Cx31-Proteine reduzieren können, wie hinsichtlich des immer noch erhöhten Farbstofftransfers festgestellt wurde. Daraus kann man schließen, dass die Mutationen G12R am N-Terminus und C86S in der 2. Transmembrandomäne des Cx31-Proteins eine Konformationsänderung und damit erhöhte Kopplung verursachen, wobei dieser Effekt durch Cx43-WT kompensiert werden konnte und sogar G12R und C86S einen transdominanten Effekt auf die Funktion der Cx43-Proteine ausüben (gain of function). <br /> C122 ist eine Mutante von Maus Cx45, bei der 26 Aminosäuren mit 9 Seinresten am CTerminus deletiert sind. Der größte Teil der C122-Proteine in HeLa C122-Transfektanten ist im perinukleären Raum lokalisiert und zeigt keine Kopplung mit dem Farbstoff Lucifer Yellow. Um die funktionelle Rolle von C122 und seinen möglichen dominanten Effekt zu untersuchen, wurde die deletierte Cx45, C122-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx45-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx45-WT und C122 wurde eine reduzierte Durchlässigkeit des Farbstoffs Lucifer Yellow und Neurobiotin festgestellt, im Vergleich zur HeLa mCx45 Einfachtransfektante. Dieser dominant negative Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle korreliert direkt mit der C122- Expression. Die Immunofluoreszenz-Analyse zeigte, dass der Membrantransport von Connexin-Proteinen auch direkt abhängig von den C122-Mengen in Doppeltransfektanten ist, wobei die Halbwertszeit und die Oligomerisierung von Cx45 und C122 kaum Unterschiede zeigten. Daraus kann man schießen, dass der C-Terminus von Cx45 für den Transport und die Funktion wichtig ist und einen dominant positiven Effekt auf den Transport von C122 ausüben kann und damit der funktionelle Defekt der C122-Proteine durch HeLa Cx45-WTProteine aufgehoben werden kann.