Untersuchungen zur Bedeutung der Serin-Phosphorylierung des Zelladhäsionsmoleküls L1 für das Neuritenwachstum

Abstract

Das Zelladhäsionsmolekül L1 ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und ist an Zelladhäsion und -migration sowie an Neuritenwachstum und -faszikulation beteiligt. Die cytoplasmatische Domäne von L1 ist zwischen verschiedenen Spezies hochkonserviert und wird von spezifischen Kinasen sowohl an Tyrosin- als auch an Serinresten phosphoryliert. Bis heute konnten vier Serine als phosphoryliert nachgewiesen werden: Ser-1152 wird von der Kinase p90^rsk, Ser-1181 von der Casein Kinase 2 und Ser-1204 und Ser-1248 werden von der Kinase erk2 phosphoryliert. Um die Bedeutung der Serin-Phosphorylierung von L1 für das basale (= unstimuliertes, zellautonomes) Neuritenwachstum zu untersuchen, wurden verschiedene L1-Mutanten hergestellt, bei denen die nachweislich phosphorylierbaren Serine gegen nicht phosphorylierbare Aminosäuren ausgetauscht wurden. Anschließend wurden B35-Neuroblastomzellen stabil mit den cDNAs der L1-Mutanten transfiziert. Positive Klone, die vergleichbare Mengen an L1 exprimierten, wurden mittels Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse identifiziert. Die Untersuchung des basalen Neuritenwachstums erfolgte an nicht ausdifferenzierten oder durch dbcAMP ausdifferenzierte B35-Neuroblastomzellen auf poly-L-Lysin als Substrat. Es konnte gezeigt werden, dass bei L1-S1152L und L1-S1181L exprimierenden Zellen das basale Neuritenwachstum ohne Ausdifferenzierung signifikant erhöht ist. Im Gegensatz dazu führten die Mutationen der Serine, die durch erk2 phosphoryliert werden können (L1-S1204L, L1-S1248L, L1-S1204L/S1248L), nach Behandlung mit dbcAMP zu einer signifikanten Reduktion des basalen Neuritenwachstums. Gleichzeitig konnte bei diesen L1-Mutanten eine Zunahme in der durchschnittlichen Anzahl an Neuriten festgestellt werden. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die Mutation einzelner phosphorylierbarer Serine der cytoplasmatischen Domäne von L1 das basale Neuritenwachstum entweder hemmen oder stimulieren kann. Daraus ist zu schließen, dass die Serin-Phosphorylierung das basale Neuritenwachstum durch unterschiedliche Mechanismen beeinflusst. Außerdem ergaben Untersuchungen der Antikörper-induzierten Endocytose von L1 und der Mutante L1-S1181L, die mittels konfokaler Laserscanning Mikroskopie durchgeführt wurden, dass die Endocytose von L1-S1181L im Vergleich zu L1 sowohl in nicht ausdifferenzierten als auch in ausdifferenzierten B35-Zellen signifikant erhöht ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung des Ser-1181 durch Casein Kinase 2 die Endocytose von L1 hemmt und damit eine wichtige Funktion bei der Regulation der Endocytose von L1 hat.

<b>Serine-phosphorylation of cell adhesion molecule L1 and its role in neurite outgrowth</b><br /> The cell adhesion molecule L1, a member of the immunoglobulin superfamily is involved in adhesion and migration of cells as well as neurite outgrowth and fasciculation of neurites. The cytoplasmic domain of neuronal L1 is highly conserved between species and known to be phosphorylated at serine and tyrosine residues by a few specific kinases. Presently it is known that only four serines of L1 are phosphorylated: Ser-1152 by p90^rsk, Ser-1181 by Casein kinase 2, Ser-1204 and Ser-1248 by erk2. To investigate the significance of L1 serine phosphorylation for basal (= unstimulated, cellautonomous) neurite outgrowth, mutants of L1 were generated in which these four serine residues were converted into non phosphorylatable amino acids. Neuronal B35 rat cells were stably transfected with the L1-cDNA constructs and positive clones with similar levels of wild type or mutated L1 were identified by indirect immunofluorescence and western blot analysis. Basal neurite outgrowth of B35 cells on poly-l-lysine was determined either with or without differentiation with dbcAMP. It could be shown that in L1-S1152L and L1-S1181L expressing cells basal neurite outgrowth is significantly enhanced when compared to L1 expressing cells without dbcAMP treatment. In contrast, mutagenesis of the serines phosphorylated by erk2 (L1-S1204L, L1-S1248L, L1-S1204L/S1248L) caused significantly reduced basal neurite outgrowth only after differetiation with dbcAMP. Simultaneously, the average neurite number of these L1-mutants increases significantly. In summary it could be shown that mutations of single serines of the cytoplasmic domain of L1 result in decreased or increased basal neurite outgrowth indicating that serine phosphorylation of L1 influences basal neurite outgrowth through different mechanisms. In addition, antibody induced endocytosis of L1 and L1-S1181L visualized by confocal laser microscopy revealed that endocytosis of L1-S1181L is significantly enhanced compared to wild-type L1 in B35 cells with and without dbcAMP treatment. From this observation it could be concluded that phosphorylation of Ser-1181 inhibits endocytosis of L1, indicating the involvement of Casein kinase 2 in the regulation of L1 endocytosis.