Etablierung und Vergleich von Multi-Colour-Fish-Techniken und Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation (MAPH) zur Detektion kryptischer Aberrationen der subtelomerischen Chromosomenregionen

Abstract

Mikroskopisch nicht sichtbare und somit kryptische Chromosomenmutationen stellen eine bedeutende Ursache für mentale Retardierung (MR) und multiple Fehlbildungen beim Menschen dar. Als Regionen mit vermehrten kryptischen Aberrationen gelten die proximal an die Telomer-DNA angrenzenden subtelomerischen Chromosomenbereiche. Die hohe Rekombinationsfrequenz der Chromosomenenden sowie zahlreiche Sequenzhomologien zwischen nichthomologen Chromosomen, welche Fehlpaarungen begünstigen, lassen auf eine hohe Aberrationsrate dieser Regionen schließen. In Kombination mit der großen Gendichte der Subtelomere ist zu erwarten, dass Mutationen in diesen Bereichen bei einer Vielzahl genetisch bedingter Störungen bislang unklarer Genese ursächlich beteiligt sind. Die wichtige ätiologische Rolle der Subtelomeraberrationen wurde vor allem bei der idiopathischen MR, die 1-2% der Bevölkerung betrifft, aufgezeigt. Die Häufigkeit kryptischer Imbalancen wurde in dieser Patientengruppe mit durchschnittlich 4,6% beziffert. Die hohe Prävalenz dieser Störungen sowie die große Zahl von 43 zu untersuchenden euchromatischen Subtelomerregionen erfordern den Einsatz hocheffizienter Techniken. <br /> Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und der Vergleich verschiedener Methoden der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) und der Multiplex Amplifiable Probe Hybridisation (MAPH) zur Erfassung kryptischer Aberrationen der Subtelomerregionen. Die Untersuchungen erfolgten an einem Kollektiv von 66 Patienten mit MR. Zunächst wurde überprüft, ob die Untersuchungseffizienz der FISH durch eine Erhöhung der Anzahl gleichzeitig dargestellter Sonden gesteigert werden konnte. Dazu wurden zwei Multi-Colour-FISH-Techniken, die Sechs-Farben-FISH und die Subtelomer-COBRA-FISH (COBRA= Combined Binary Ratio Labelling) entwickelt, die eine simultane Analyse aller 43 euchromatischen Subtelomere in sieben bzw. zwei Hybridisierungen gewährleisten. Diese Methoden wurden sowohl untereinander als auch mit dem kommerziell erhältlichen „ToTelVysion^TM Multi-Colour FISH Probe Panel“ verglichen, bei dem eine vollständige Subtelomeranalyse 15 Hybridisierungen erfordert. Die Erhöhung der Anzahl gleichzeitig dargestellter Sonden erbrachte aufgrund der zunehmenden methodischen Komplexität keine Steigerung der Untersuchungseffizienz. Eher erschien ein spezifischer Einsatz der FISH-Methoden in Abhängigkeit von der Menge und Qualität des vorhandenen Untersuchungsmaterials sinnvoll.<br /> Da sich die FISH aufgrund des hohen zeitlichen und methodischen Aufwandes nur bedingt für eine Analyse großer Kollektive eignet, wurde die Subtelomer-MAPH als Hochdurchsatzverfahren zur Subtelomeranalyse etabliert. Diese Methode ermöglicht die simultane Untersuchung sämtlicher Subtelomere bei zwölf Patienten gleichzeitig. Als molekulargenetisches Verfahren gewährleistet sie im Gegensatz zur FISH zwar keine exakte Bestimmung der chromosomalen Lokalisation der untersuchten Regionen, konnte jedoch in den eigenen Untersuchungen den Aufwand der FISH-Analysen, die sich nur noch auf Regionen mit auffälligen MAPH-Befunden beschränkten, um mehr als 98% verringern. Dies stellt einen wichtigen methodischen Fortschritt in der Diagnostik kryptischer Aberrationen der Subtelomere dar.