Untersuchungen zur Bedeutung des Gens yhgI für die Stressanpassung von Halomonas elongata DSM 2581T und Escherichia coli K-12
Untersuchungen zur Bedeutung des Gens yhgI für die Stressanpassung von Halomonas elongata DSM 2581T und Escherichia coli K-12
Dokument öffnen (5.8MB)Art der Hochschulschrift
DissertationPrüfungsdatum
06.07.2004Datum der Veröffentlichung
2004Erstgutachter
Galinski, Erwin A.Zweitgutachter
Trüper, Hans GeorgMetadaten
Zur Langanzeige
Zitierbare Links 
Inhalt
Halomonas elongata ABU44, eine salzsensitive Tn1732-Mutante von H. elongata DSM 2581T (Wildtyp), zeigt bei geringer Salinität (2 % NaCl) ein dem Wildtyp vergleichbares Wachstum und bei 16 % NaCl einen Ausfall des Wachstums in Mineralsalzmedium. Die Tn1732-Insertion erfolgte innerhalb der Promotorregionen zweier entgegengesetzt orientierter Gene, yhgI und metH, und führte so zu einer Beeinträchtigung eines unbekannten Mechanismus der Osmoadaptation von H. elongata. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser neue Mechanismus der Osmoadaptation vergleichend an H. elongata DSM 2581T und E. coli K-12 untersucht.
Mittels Mutagenese konnte für H. elongata eine Beteiligung des yhgI-Gens an der Osmoadaptation nachgewiesen werden. Die yhgI-Deletionsmutanten H. elongata KB5 und KB6 zeigten einen salz-sensitiven Phänotyp, die metH-Insertionsmutante H. elongata KB4 einen auxotrophen Phänotyp. Das Wachstumsdefizit von KB5 und KB6 ist teilweise durch plasmidkodiertes yhgI aus E. coli K-12 komplementierbar. Gleiches gilt bei chromosomaler Integration des E. coli Gens (H. elongata KB7). Auch die Deletion von yhgI aus E. coli K-12 führte zu einem salzsensitiven Stamm (E. coli BK1). Dessen Salzsensitivität ist vollständig durch kloniertes yhgI aus H. elongata komplementierbar.
Hinweise auf eine Beteiligung von yhgI an der Kompetenz zur DNA-Aufnahme konnten mittels des verwendeten BacterioMatch Two-Hybrid-Systems nicht erhärtet werden. Es konnten keine Wechsel-wirkungen zwischen YhgI und YhgH, einer Komponente des Kompetenzapparates, nachgewiesen werden. Unterschiedliche Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten ebenfalls nicht auf eine Beteiligung von YhgI und YhgH an einem gemeinsamen zellulären Prozess hin. Auswertungen von Genomsequenzen symbiontischer Stämme (Buchnera, Wigglesworthia, Blochmannia) ließen auf eine alternative, wichtige Funktion im Kerngenom von gamma-Proteobakterien schließen.
Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten auf mehrere regulatorische Bereiche, welche die Expression von yhgI steuern, hin. Im Bereich des ORFs von yhgH konnten mittels RACE-PCR drei Transkriptionsstartpunkte für yhgI und die zugehörigen Promotoren identifiziert werden. Es handelte sich um sig70-, sig32- und sig54-abhängige Promotoren. Stromaufwärts von yhgI aus H. elongata konnte ein sig70- und ein sig32abhängiger Promotor bestimmt werden.
Unterschiedliche Autoren wiesen bei E. coli eine erhöhte Expression von yhgI als Antwort auf die Einwirkung von Kanamycin oder Falschfaltung von Proteinen nach. Daran anknüpfende Wachstums-experimente unter steigenden Inkubationstemperaturen ergaben keine erhöhte Hitzesensitivität der yhgI-Mutanten von E. coli und H. elongata in Komplexmedium. Untersuchungen des Wachstums in Mineralsalzmedium unter steigenden Harnstoffkonzentrationen zeigten eine erhöhte Harnstoff-sensitivität von E. coli BK1. Alle H. elongata Stämme tolerierten mit steigender Salinität auch steigende Harnstoffkonzentrationen. Eine erhöhte Harnstoffsensitivität war bei den yhgI-Mutanten von H. elongata nicht zu erkennen.
YhgI aus H. elongata konnte als (His)6-tag Fusionsprotein in E. coli BL21 (DE3) pETY5 überexprimiert und mittels Nickelchelat-Chromatographie aufgereinigt werden. Die Aktivität eines Thioredoxin, auf die sich bei den Untersuchungen der YhgI-Sequenz Hinweise ergeben hatten, konnte für YhgI-(His)6 nicht nachgewiesen werden. Gleichermaßen konnte in einem Absorptionsspektrum keine Hinweise auf Cofaktoren wie z.B. FeS-Cluster oder NAD(P)+/NAD(P)H gefunden werden. So ergaben sich auch keine Hinweise auf mögliche alternative Funktionen. Western-Blot-Analysen der Zellfraktionen deuten auf eine Membranassoziation von YhgI aus H. elongata hin.
Mittels Mutagenese konnte für H. elongata eine Beteiligung des yhgI-Gens an der Osmoadaptation nachgewiesen werden. Die yhgI-Deletionsmutanten H. elongata KB5 und KB6 zeigten einen salz-sensitiven Phänotyp, die metH-Insertionsmutante H. elongata KB4 einen auxotrophen Phänotyp. Das Wachstumsdefizit von KB5 und KB6 ist teilweise durch plasmidkodiertes yhgI aus E. coli K-12 komplementierbar. Gleiches gilt bei chromosomaler Integration des E. coli Gens (H. elongata KB7). Auch die Deletion von yhgI aus E. coli K-12 führte zu einem salzsensitiven Stamm (E. coli BK1). Dessen Salzsensitivität ist vollständig durch kloniertes yhgI aus H. elongata komplementierbar.
Hinweise auf eine Beteiligung von yhgI an der Kompetenz zur DNA-Aufnahme konnten mittels des verwendeten BacterioMatch Two-Hybrid-Systems nicht erhärtet werden. Es konnten keine Wechsel-wirkungen zwischen YhgI und YhgH, einer Komponente des Kompetenzapparates, nachgewiesen werden. Unterschiedliche Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten ebenfalls nicht auf eine Beteiligung von YhgI und YhgH an einem gemeinsamen zellulären Prozess hin. Auswertungen von Genomsequenzen symbiontischer Stämme (Buchnera, Wigglesworthia, Blochmannia) ließen auf eine alternative, wichtige Funktion im Kerngenom von gamma-Proteobakterien schließen.
Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten auf mehrere regulatorische Bereiche, welche die Expression von yhgI steuern, hin. Im Bereich des ORFs von yhgH konnten mittels RACE-PCR drei Transkriptionsstartpunkte für yhgI und die zugehörigen Promotoren identifiziert werden. Es handelte sich um sig70-, sig32- und sig54-abhängige Promotoren. Stromaufwärts von yhgI aus H. elongata konnte ein sig70- und ein sig32abhängiger Promotor bestimmt werden.
Unterschiedliche Autoren wiesen bei E. coli eine erhöhte Expression von yhgI als Antwort auf die Einwirkung von Kanamycin oder Falschfaltung von Proteinen nach. Daran anknüpfende Wachstums-experimente unter steigenden Inkubationstemperaturen ergaben keine erhöhte Hitzesensitivität der yhgI-Mutanten von E. coli und H. elongata in Komplexmedium. Untersuchungen des Wachstums in Mineralsalzmedium unter steigenden Harnstoffkonzentrationen zeigten eine erhöhte Harnstoff-sensitivität von E. coli BK1. Alle H. elongata Stämme tolerierten mit steigender Salinität auch steigende Harnstoffkonzentrationen. Eine erhöhte Harnstoffsensitivität war bei den yhgI-Mutanten von H. elongata nicht zu erkennen.
YhgI aus H. elongata konnte als (His)6-tag Fusionsprotein in E. coli BL21 (DE3) pETY5 überexprimiert und mittels Nickelchelat-Chromatographie aufgereinigt werden. Die Aktivität eines Thioredoxin, auf die sich bei den Untersuchungen der YhgI-Sequenz Hinweise ergeben hatten, konnte für YhgI-(His)6 nicht nachgewiesen werden. Gleichermaßen konnte in einem Absorptionsspektrum keine Hinweise auf Cofaktoren wie z.B. FeS-Cluster oder NAD(P)+/NAD(P)H gefunden werden. So ergaben sich auch keine Hinweise auf mögliche alternative Funktionen. Western-Blot-Analysen der Zellfraktionen deuten auf eine Membranassoziation von YhgI aus H. elongata hin.
Schlagwörter
Halomonas elongata, yhgI, Osmoadaption, Stressanpassung, Chaperone, Thioredoxin, RACE-PCR, Two-Hybrid, Escherichia coli
Klassifikation (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieBurdziak, Daniel: Untersuchungen zur Bedeutung des Gens yhgI für die Stressanpassung von Halomonas elongata DSM 2581T und Escherichia coli K-12. - Bonn, 2004. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-03866
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-03866
@phdthesis{handle:20.500.11811/2056,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-03866,
author = {{Daniel Burdziak}},
title = {Untersuchungen zur Bedeutung des Gens yhgI für die Stressanpassung von Halomonas elongata DSM 2581T und Escherichia coli K-12},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2004,
note = {Halomonas elongata ABU44, eine salzsensitive Tn1732-Mutante von H. elongata DSM 2581T (Wildtyp), zeigt bei geringer Salinität (2 % NaCl) ein dem Wildtyp vergleichbares Wachstum und bei 16 % NaCl einen Ausfall des Wachstums in Mineralsalzmedium. Die Tn1732-Insertion erfolgte innerhalb der Promotorregionen zweier entgegengesetzt orientierter Gene, yhgI und metH, und führte so zu einer Beeinträchtigung eines unbekannten Mechanismus der Osmoadaptation von H. elongata. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser neue Mechanismus der Osmoadaptation vergleichend an H. elongata DSM 2581T und E. coli K-12 untersucht.
Mittels Mutagenese konnte für H. elongata eine Beteiligung des yhgI-Gens an der Osmoadaptation nachgewiesen werden. Die yhgI-Deletionsmutanten H. elongata KB5 und KB6 zeigten einen salz-sensitiven Phänotyp, die metH-Insertionsmutante H. elongata KB4 einen auxotrophen Phänotyp. Das Wachstumsdefizit von KB5 und KB6 ist teilweise durch plasmidkodiertes yhgI aus E. coli K-12 komplementierbar. Gleiches gilt bei chromosomaler Integration des E. coli Gens (H. elongata KB7). Auch die Deletion von yhgI aus E. coli K-12 führte zu einem salzsensitiven Stamm (E. coli BK1). Dessen Salzsensitivität ist vollständig durch kloniertes yhgI aus H. elongata komplementierbar.
Hinweise auf eine Beteiligung von yhgI an der Kompetenz zur DNA-Aufnahme konnten mittels des verwendeten BacterioMatch Two-Hybrid-Systems nicht erhärtet werden. Es konnten keine Wechsel-wirkungen zwischen YhgI und YhgH, einer Komponente des Kompetenzapparates, nachgewiesen werden. Unterschiedliche Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten ebenfalls nicht auf eine Beteiligung von YhgI und YhgH an einem gemeinsamen zellulären Prozess hin. Auswertungen von Genomsequenzen symbiontischer Stämme (Buchnera, Wigglesworthia, Blochmannia) ließen auf eine alternative, wichtige Funktion im Kerngenom von gamma-Proteobakterien schließen.
Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten auf mehrere regulatorische Bereiche, welche die Expression von yhgI steuern, hin. Im Bereich des ORFs von yhgH konnten mittels RACE-PCR drei Transkriptionsstartpunkte für yhgI und die zugehörigen Promotoren identifiziert werden. Es handelte sich um sig70-, sig32- und sig54-abhängige Promotoren. Stromaufwärts von yhgI aus H. elongata konnte ein sig70- und ein sig32abhängiger Promotor bestimmt werden.
Unterschiedliche Autoren wiesen bei E. coli eine erhöhte Expression von yhgI als Antwort auf die Einwirkung von Kanamycin oder Falschfaltung von Proteinen nach. Daran anknüpfende Wachstums-experimente unter steigenden Inkubationstemperaturen ergaben keine erhöhte Hitzesensitivität der yhgI-Mutanten von E. coli und H. elongata in Komplexmedium. Untersuchungen des Wachstums in Mineralsalzmedium unter steigenden Harnstoffkonzentrationen zeigten eine erhöhte Harnstoff-sensitivität von E. coli BK1. Alle H. elongata Stämme tolerierten mit steigender Salinität auch steigende Harnstoffkonzentrationen. Eine erhöhte Harnstoffsensitivität war bei den yhgI-Mutanten von H. elongata nicht zu erkennen.
YhgI aus H. elongata konnte als (His)6-tag Fusionsprotein in E. coli BL21 (DE3) pETY5 überexprimiert und mittels Nickelchelat-Chromatographie aufgereinigt werden. Die Aktivität eines Thioredoxin, auf die sich bei den Untersuchungen der YhgI-Sequenz Hinweise ergeben hatten, konnte für YhgI-(His)6 nicht nachgewiesen werden. Gleichermaßen konnte in einem Absorptionsspektrum keine Hinweise auf Cofaktoren wie z.B. FeS-Cluster oder NAD(P)+/NAD(P)H gefunden werden. So ergaben sich auch keine Hinweise auf mögliche alternative Funktionen. Western-Blot-Analysen der Zellfraktionen deuten auf eine Membranassoziation von YhgI aus H. elongata hin.},
url = {https://hdl.handle.net/20.500.11811/2056}
}
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-03866,
author = {{Daniel Burdziak}},
title = {Untersuchungen zur Bedeutung des Gens yhgI für die Stressanpassung von Halomonas elongata DSM 2581T und Escherichia coli K-12},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2004,
note = {Halomonas elongata ABU44, eine salzsensitive Tn1732-Mutante von H. elongata DSM 2581T (Wildtyp), zeigt bei geringer Salinität (2 % NaCl) ein dem Wildtyp vergleichbares Wachstum und bei 16 % NaCl einen Ausfall des Wachstums in Mineralsalzmedium. Die Tn1732-Insertion erfolgte innerhalb der Promotorregionen zweier entgegengesetzt orientierter Gene, yhgI und metH, und führte so zu einer Beeinträchtigung eines unbekannten Mechanismus der Osmoadaptation von H. elongata. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser neue Mechanismus der Osmoadaptation vergleichend an H. elongata DSM 2581T und E. coli K-12 untersucht.
Mittels Mutagenese konnte für H. elongata eine Beteiligung des yhgI-Gens an der Osmoadaptation nachgewiesen werden. Die yhgI-Deletionsmutanten H. elongata KB5 und KB6 zeigten einen salz-sensitiven Phänotyp, die metH-Insertionsmutante H. elongata KB4 einen auxotrophen Phänotyp. Das Wachstumsdefizit von KB5 und KB6 ist teilweise durch plasmidkodiertes yhgI aus E. coli K-12 komplementierbar. Gleiches gilt bei chromosomaler Integration des E. coli Gens (H. elongata KB7). Auch die Deletion von yhgI aus E. coli K-12 führte zu einem salzsensitiven Stamm (E. coli BK1). Dessen Salzsensitivität ist vollständig durch kloniertes yhgI aus H. elongata komplementierbar.
Hinweise auf eine Beteiligung von yhgI an der Kompetenz zur DNA-Aufnahme konnten mittels des verwendeten BacterioMatch Two-Hybrid-Systems nicht erhärtet werden. Es konnten keine Wechsel-wirkungen zwischen YhgI und YhgH, einer Komponente des Kompetenzapparates, nachgewiesen werden. Unterschiedliche Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten ebenfalls nicht auf eine Beteiligung von YhgI und YhgH an einem gemeinsamen zellulären Prozess hin. Auswertungen von Genomsequenzen symbiontischer Stämme (Buchnera, Wigglesworthia, Blochmannia) ließen auf eine alternative, wichtige Funktion im Kerngenom von gamma-Proteobakterien schließen.
Deletionen von yhgH in E. coli K-12 deuteten auf mehrere regulatorische Bereiche, welche die Expression von yhgI steuern, hin. Im Bereich des ORFs von yhgH konnten mittels RACE-PCR drei Transkriptionsstartpunkte für yhgI und die zugehörigen Promotoren identifiziert werden. Es handelte sich um sig70-, sig32- und sig54-abhängige Promotoren. Stromaufwärts von yhgI aus H. elongata konnte ein sig70- und ein sig32abhängiger Promotor bestimmt werden.
Unterschiedliche Autoren wiesen bei E. coli eine erhöhte Expression von yhgI als Antwort auf die Einwirkung von Kanamycin oder Falschfaltung von Proteinen nach. Daran anknüpfende Wachstums-experimente unter steigenden Inkubationstemperaturen ergaben keine erhöhte Hitzesensitivität der yhgI-Mutanten von E. coli und H. elongata in Komplexmedium. Untersuchungen des Wachstums in Mineralsalzmedium unter steigenden Harnstoffkonzentrationen zeigten eine erhöhte Harnstoff-sensitivität von E. coli BK1. Alle H. elongata Stämme tolerierten mit steigender Salinität auch steigende Harnstoffkonzentrationen. Eine erhöhte Harnstoffsensitivität war bei den yhgI-Mutanten von H. elongata nicht zu erkennen.
YhgI aus H. elongata konnte als (His)6-tag Fusionsprotein in E. coli BL21 (DE3) pETY5 überexprimiert und mittels Nickelchelat-Chromatographie aufgereinigt werden. Die Aktivität eines Thioredoxin, auf die sich bei den Untersuchungen der YhgI-Sequenz Hinweise ergeben hatten, konnte für YhgI-(His)6 nicht nachgewiesen werden. Gleichermaßen konnte in einem Absorptionsspektrum keine Hinweise auf Cofaktoren wie z.B. FeS-Cluster oder NAD(P)+/NAD(P)H gefunden werden. So ergaben sich auch keine Hinweise auf mögliche alternative Funktionen. Western-Blot-Analysen der Zellfraktionen deuten auf eine Membranassoziation von YhgI aus H. elongata hin.},
url = {https://hdl.handle.net/20.500.11811/2056}
}
Die folgenden Nutzungsbestimmungen sind mit dieser Ressource verbunden:
