Muck, Andrea: Klonierung und pharmakologische Charakterisierung des Noradrenalintransporters (NAT) der Maus und kovalente Markierung und partielle Aufreinigung des humanen NAT-Proteins. - Bonn, 2004. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-04271
@phdthesis{handle:20.500.11811/2088,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-04271,
author = {{Andrea Muck}},
title = {Klonierung und pharmakologische Charakterisierung des Noradrenalintransporters (NAT) der Maus und kovalente Markierung und partielle Aufreinigung des humanen NAT-Proteins},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2004,
note = {Der Noradrenalintransporter (NAT) in der Plasmamembran noradrenerger Neurone ist verantwortlich für die rasche Inaktivierung von Noradrenalin (NA) aus dem synaptischen Spalt und damit für die Aufrechterhaltung der NA-Homöostase. Der NAT gehört zur Familie der Na+/Cl--abhängigen Neurotransmittertransporter und hier, zusammen mit dem Serotonintransporter (SERT) und dem Dopamintransporter (DAT), zur Subfamilie der Monoamintransporter. Der Transporter ist Angriffspunkt klinisch bedeutender Antidepressiva (z.B. Desipramin, Nortriptylin, Maprotilin) und das NAT-Gen ist ein Kandidatengen für Depression. Für die Entwicklung selektiverer und nebenwirkungsärmerer Antidepressiva ist die Kenntnis der Ligand-Bindungsstelle(n) des humanen NAT (hNAT) von Bedeutung. Die vorliegende Arbeit stellt einen Beitrag dar, diesem Ziel etwas näher zu kommen.
Eine gesicherte Kenntnis hochkonservierter Aminosäure (AS)-Sequenzbereiche von NATs verschiedener Spezies liefert starke Hinweise auf wichtige gemeinsame Funktionsbereiche, wie z.B. die Ligand-Bindungsstellen. Nur bei einer Spezies abweichende AS in konservierten Bereichen können gefundene Speziesunterschiede erklären. Ein erstes Ziel der Arbeit war daher, eine weitere Speziesvariante des NAT, den NAT der Maus (mNAT) zu klonieren, in HEK293-Zellen funktionell zu exprimieren und pharmakologisch zu charakterisieren. Der mNAT weist mit dem NAT des Rindes (bNAT), des Menschen (hNAT) und der Ratte (rNAT) eine 91 bis 94%ige AS-Identität auf. Bei der Klonierung des mNAT wurde eine offensichtlich natürlich vorkommende Variante, mNAT-I505V, in welcher aufgrund eines Basenaustauschs Isoleucin in Position 505 gegen Valin ausgetauscht war, gefunden. Diese Variante und der durch Mutagenese hergestellte mNAT-Wild-Typ (mNAT-WT) wurden pharmakologisch auf Eigenschaften des Transports von [3H]-NA und der Bindung des selektiven NAT-Inhibitor [3H]-Nisoxetin untersucht. Die kinetischen Konstanten des Transports von [3H]-NA (Km und Vmax) und der Bindung von [3H]-Nisoxetin (KD und Bmax) zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Varianten, d.h. der AS-Austausch hatte keinen Einfluss auf die Affinität (Km, KD) dieser Liganden (NA und Nisoxetin) und die maximale Transportrate bzw. Membranexpression (Vmax, Bmax). Auch in Bezug auf die Na+/Cl- -Abhängigkeit unterschieden sich die zwei Varianten nicht. Bezüglich der Affinitäten (gemessen als pKi-Werte) der Substrate Dopamin, Adrenalin und MPP+ und der Inhibitoren Desipramin und Imipramin zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Nur Cocain wies in diesem Vergleich eine höhere Affinität zum mNAT-I505V auf.
Beim Vergleich der am mNAT-WT erhobenen Befunde mit publizierten Daten für den hNAT, bNAT und rNAT zeigten sich, bis auf Desipramin und Dopamin, einige kleine, aber signifikante Unterschiede: 1) Der mNAT-WT besitzt eine geringere Affinität zu NA als die NATs der anderen Spezies; 2) rNAT und mNAT zeigen im Vergleich zu hNAT und bNAT eine geringere Affinität für Adrenalin und Cocain; 3) der mNAT-WT hatte eine höhere Affinität zu dem Antidepressivum Imipramin als die anderen Transporter; 4) das Neurotoxin und NAT-Substrat MPP+ hat zum mNAT-WT eine geringere Affinität als zu den anderen NATs. Der Speziesvergleich zeigt also die enge Verwandtschaft des Maus- und Ratten-NAT. Die geringen aber signifikanten Änderung im pharmakologischen Verhalten der Transporter der einzelnen Spezies unterstreicht, dass auch kleinste Variationen der Aminosäuresequenz die Ligandbindung und die Funktion der Transporter beeinflussen können. Das Fehlen von gravierenden Unterschieden zwischen den Transportern zeigt jedoch, dass der mNAT-WT die typischen Eigenschaften eines NAT aufweist.
Das noradrenerge Neurotoxin Xylamin ist ein "Suizidsubstrat" des NAT, denn es bindet während des Transports kovalent an den NAT; daher eignet sich Xylamin zur Markierung von AS der Ligandbindungsstelle des NAT. Diese AS lassen sich identifizieren, wenn es gelingt das NAT-Protein aufzureinigen. Ein weiteres Ziel war daher die Charakterisierung der Interaktion dieses ß-Haloalkylamins mit dem NAT und die Entwicklung von Methoden zur Isolierung des NAT. Für diese Untersuchungen wurde jedoch nicht der "normale" hNAT (Wildtyp-hNAT) eingesetzt sondern ein hNAT, der sich durch die Einführung von Polyhistidinresten mittels Metallchelat-Affinitätschromatographie leichter aufreinigen und mittels Antikörpern gegen ein zusätzliches Epitop leichter nachweisen lässt (z.B. im Western-Blot). Dieser hNAT-His mit einem "Polyhistidin-Anhang" ("His-Tag") und einem "Express-Epitop" am intrazellulären N-Terminus wurde zunächst auf eventuelle Änderungen seiner Funktion und Pharmakologie überprüft. Mit Hilfe der Bmax der [3H]-Nisoxetin-Bindung konnte gezeigt werden, dass dieser Transporter in ausreichender Menge in der Zellmembran transfizierter CHO-Zellen exprimiert wird, wobei er sich in seiner Affinität zu [3H]-Nisoxetin nicht vom Wildtyp-hNAT unterscheidet. Auch die Affinität zu seinem Substrat [3H]-NA wurde nicht beeinflusst. Allerdings war die Vmax des NA-Transports und die aus Vmax und Bmax errechnete Turnover-Zahl (Anzahl von Transportzyklen/min) des hNAT-His im Vergleich zum Wildtyp-hNAT deutlich verringert. Dies weist auf einer verminderte Transportleistung des hNAT-His durch die Einführung der Reste im N-Terminus hin. Sowohl der NA-Transport als auch die Nisoxetin-Bindung wurden durch Xylamin zeit- und konzentrationsabhängig gehemmt. Der Hemmeffekt blieb auch nach Isolierung der Zellmembranen bestehen, d.h. er war im [3H]-Nisoxetin-Bindungstest an Zellmembranen noch voll erhalten. Die gleichzeitige Anwesenheit des Inhibitors Cocain oder des Substrats NA (bei der Exposition der Zellen mit Xylamin) verhinderte diese kovalente Interaktion von Xylamin, was beweist, dass Xylamin an die Ligandbindungsstelle(n) des NAT bindet.
Schließlich wurden noch Methoden zur Aufreinigung des hNAT-His entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass eine partielle Aufreinigung des hNAT-His mit Hilfe der Metallchelat-Affinitätschromatographie möglich ist. Mittels SDS-PAGE und Western-Blots konnte nachgewiesen werden, dass mit dieser Affinitätschromatographie das hNAT-Protein unter denaturierenden Bedingungen um den Faktor 47 und unter nativen Bedingungen um den Faktor 114 aufgereinigt wird.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/2088}
}

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