Neue Strukturen und Targets für β-Laktamase-Inhibitoren

Abstract

Bei der Therapie von Infektionen mit gramnegativen Krankheitserregern kommen häufig ß-Laktam-Antibiotika zum Einsatz. Die Wirksamkeit dieser Substanzen wird durch die Bildung von β-Laktamasen stark beeinträchtigt. Eine Vielzahl dieser Enzyme ist chromosomal kodiert und wird erst nach Induktion durch β-Laktame exprimiert. Sie gelangen dann in das Periplasma und hydrolysieren dort das Antibiotikum. Eine besondere klinische Bedeutung erhalten diese induzierbaren β-Laktamasen, wenn sie durch eine Mutation in den regulatorischen Genen konstitutiv exprimiert werden. <br /> Bei einer weltweit ansteigenden Resistenz von Bakterien gegenüber vorhandenen Antibiotika, ist es dringend nötig neue Wirkstoffe bzw. Wirkstoffklassen zu entwickeln. Dazu sind genaue Kenntnisse über den Regulationsmechanismus der β-Laktamase nötig. Bei vielen gramnegativen Spezies, insbesondere den Enterobakterien <i>Citrobacter spp. </i>und<i> Enterbacter spp.</i> ist dies weitgehend der Fall. Die β-Laktam-Antibiotika bewirken eine vermehrte Bildung von Zellwandmetaboliten. Diese Moleküle werden in das Cytoplasma transportiert und binden dort an den Transkriptionsfaktor der ß-Laktamase, AmpR. Dabei verdrängen sie UDP-MurNac-Pentapeptid, eine Mureinvorstufe, die im Normalzustand an AmpR gebunden ist und das Protein in einer reprimierenden Konformation hält. Durch die Bindung der Mureinmetabolite ändert sich vermutlich die dreidimensionale Struktur von AmpR und ermöglicht die Transkription des β-Laktamasegens. <br /> Welche Zellwandabbauprodukte an AmpR binden ist noch nicht vollständig aufgeklärt. In Frage kommen das (1,6-anhydro)-MurNac-Tripeptid und das (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptid. Ziel dieser Arbeit war die Durchführung eines Transkriptions-Assays, der die Wirkung beider Moleküle auf die Laktamase-Transkription vergleichend zeigen sollte. Dazu wurden einzelne Komponenten benötigt, die im Rahmen dieser Arbeit isoliert und gereinigt werden sollten. <br /> Durch Überexpression in <i>E. coli</i> konnte der Transkriptionsfaktor AmpR aus <i>C. freundii</i> in großen Mengen rein gewonnen werden. Das Protein fiel bei der Expression in unlöslichen Inclusion Bodies aus und konnte durch Solubilisierungs- und Renaturierungsprozesse vermutlich in seine native Struktur gebracht werden. Durch Fusion des NusA-Proteins an die AmpR-Sequenz ergab sich auch die Möglichkeit das Protein in löslicher Form zu reinigen. Beide isolierten AmpR-Proteine zeigten in DNA-Bindungstests die gleiche DNA-Bindeaktivität. <br /> Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die potentiell aktivierenden Liganden (1,6-an-hydro)-MurNac-Tripeptid und (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptid aus <i>E. coli</i>-Zellen isoliert und mittels HPLC gereinigt. <br /> Durchgeführte Transkriptions-Assays konnten keine Unterschiede in der β-Laktamase-Transkription nachweisen. Dabei war es unerheblich, ob die entstandene mRNA mittels herkömmlicher RT-PCR oder mittels Real-Time RT-PCR detektiert wurde. In <i>in-vivo</i> Induktionsversuchen stellte sich heraus, dass die verwendete DNA möglicherweise nicht in der Lage ist als funktionales Template für die <i>In-vitro</i> Transkription zu dienen.<br /> Zusätzlich wurden deshalb <i>In-vivo </i>Studien durchgeführt, bei denen die potentiell aktivierenden Liganden in das Kulturmedium gegeben wurden. Auch in diesen Experimenten konnten keine Unterschiede in der β-Laktamase-Transkription gemessen werden. Induktionsversuche mit dem starken Induktor Imipenem waren dagegen erfolgreich. Die Ursache für die nicht vorhandene Wirkung von (1,6-anhydro)-MurNac-Tripeptid und (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptid, liegt vermutlich in der Substratspezifität von AmpG, denn diese Permease, die Zellwandmetabolite in das Cytoplasma transportiert, ist spezifisch für Moleküle mit Disaccharidanteil. Erst im Cytoplasma kommt es zur Abspaltung eines Zuckers und zur Freisetzung der induzierenden Liganden.<br /> Im Rahmen einer Kooperation sollte außerdem die dreidimensionale Struktur des AmpR-Proteins aufgeklärt werden. Dazu wurde gereinigtes AmpR- und NusA/AmpR-Protein unter verschiedenen Bedingungen in Kristallisationsversuchen nach der sogenannten "hanging-drop"-Methode eingesetzt. Bislang sind die entstandenen Kristalle allerdings noch zu klein, um sie einer Röntgenstrukturanalyse zu unterziehen.