Entwicklung eines auf Kunststoffpolymeren basierenden Analysesystems zum Nachweis von humanpathogenen und Verderbnis erregenden Mikroorganismen in Lebensmitteln und weiterführende gruppenspezifische Untersuchungen zur Charakterisierung von <i>Clostridium perfringens</i>

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Analysensysteme auf Basis synthetischer Polymere entwickelt. Diese Systeme basieren auf der Abicap®-Technologie, bei der sich der Kunststoffträger in Form einer Fritte (5 x 5 mm) in einem Abicap®-Röhrchen (Kunststoffsäule mit 750 µl Fassungsvermögen) befindet. Durch eine umfangreiche Charakterisierung der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Kunststoffkörpern mit humanpathogenen und Verderbnis erregenden Mikroorganismen konnte die Grundlage geschaffen werden, leistungsfähige Methoden zum Nachweis von Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes und Salmonellen sowie zur Anreicherung von Mikroorganismen aus großen Probenvolumina zu entwickeln.<br /> Der für Legionella pneumophila entwickelte Durchfluss-Sandwich-ELISA weist eine Nachweisgrenze von < 10 KbE/ml auf und ist als Schnellmethode in die Routineanalytik integrierbar. Aufgrund der auf die Serogruppe 1 begrenzten Spezifität kann diese Methode die amtlichen Analyseverfahren sinnvoll ergänzen aber nicht vollständig ersetzen.<br /> Die entwickelte Methode zum Nachweis von Salmonellen beruht auf der Kombination der Abicap®-Technologie als Anreicherungsschritt und einer Detektion mittels Realtime-PCR (Nachweisgrenze < 10 KbE/ml). Dieses System ist in der Lage, neben den amtlich vorgeschriebenen, kulturellen Methoden eingesetzt zu werden. Dabei ist eine deutliche Zeitersparnis, insbesondere durch Verkürzung der Voranreicherung und Verzicht der Selektivanreicherung, möglich. <br /> Der Nachweis von Listeria monocytogenes besteht aus einer Anreicherung mittels Affini-tätsmodul (Kunststoff-Fritte mit modifizierter Aminooberfläche) und anschließender PCR-Detektion. Dieser Ansatz stellt eine neue, kostengünstige und effektive Alternative zur Isolierung von Mikroorganismen aus Lebensmitteln dar (Nachweisgrenze < 10 KbE/ml).<br /> Die Abicap®-Technologie wurde auch zur Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Clostridium perfringens herangezogen. Die Etablierung eines Abicap®-Sandwich-ELISA´s konnte nicht erbracht werden. Dies ist vermutlich auf eine zu geringe Spezifität der Fänger- und Detektorantikörper zurückzuführen. <br /> Die hohe Anzahl der durch Clostridium perfringens bedingten Lebensmittelvergiftungen wird durch ein Enterotoxin erzeugt, welches nur fünf Prozent der Spezies bilden können. Die Identifizierung und Charakterisierung von Enterotoxin bildenden Stämmen ist demnach von besonderer Bedeutung, weshalb in der vorliegenden Arbeit neben der Entwicklung von mikrobiologischen Analysenverfahren gruppenspezifische Untersuchungen mit Clostridium perfringens Isolaten erfolgten. Dazu wurden die Zellbestandteile/Stoffwechselprodukte (FT-IR-Spektroskopie), die Antibiotikaempfindlichkeit und das Sporulationsverhalten der Stämme untersucht.<br /> Die FT-IR-Spektroskopie zeigte zwei Hauptcluster mit einer geringen spektralen Distanz (maximal 2,5), was auf eine hohe Ähnlichkeit/Verwandtschaft der untersuchten Stämme hinweist. Die insgesamt sechs eingesetzten Enterotoxinbildner waren gleichmäßig über beide Cluster verteilt und wiesen keine unterscheidbaren Merkmale gegenüber den nicht Enterotoxin bildenden Stämmen auf.<br /> Die untersuchten enterotoxinbildenden Clostridium perfringens Stämme zeigten gegen-über den eingesetzten Antibiotika vergleichbare Empfindlichkeiten. Signifikante Unterschiede konnten beim Einsatz von Doxycyclin festgestellt werden. Enterotoxinbildner wurden hier bereits bei der Verwendung von 0,25 µg/ml gehemmt, wohingegen diese Konzentration bei 70 % der nicht Enterotoxin bildenden Stämme keine Wirkung zeigte. Ein Stamm stellte sich bei einer Doxycyclinkonzentration von bis zu 32 µg/ml als unempfindlich heraus. <br /> Die untersuchten Enterotoxin bildenden Clostridium perfringens Stämme waren nach einer Pasteurisation in DRCM-Bouillon zur Sporulation fähig. Bei den nicht Enterotoxin bildenden Stämme zeigten nur 1/3 der untersuchten Stämme bei allen durchgeführten Paralleluntersuchungen eine Sporulation. Ein Viertel der Nicht-Enterotoxinbildner konnte unter diesen Bedingungen keine Sporen ausbilden.