Charakterisierung und Reinigung des Hirnenzyms L-Aspartat-N-Acetyltransferase

Abstract

Das N-Acetyl-L-Aspartat spielt eine wichtige Rolle bei den Hirnfunktionen. Es dient als Indikator für neuronale Integrität und wird daher seit Jahren als diagnostischer Marker neurodegenerativer Krankheiten in der klinischen und experimentellen Medizin verwendet. Sein synthetisierendes Enzym - die L-Aspartat-N-Acetyltransferase - ist bis heute noch nicht gereinigt (die Aminosäuresequenz ist nicht bekannt) und nur unzureichend charakterisiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung und Reinigung des Hirnenzyms L-Aspartat-N-Acetyltransferase. <br /> Die Spezifität der L-Aspartat-N-Acetyltransferase- Nachweisreaktion wurde durch die Bestätigung der Substrat- und Organspezifität, durch den spezifischen Enzymabbau des N-Acetyl-L-Aspartats sowie durch die Produktinhibition nachgewiesen. Die Reaktionsbedingungen (pH, Temperatur, Dauer der Reaktion, Proteingehalt sowie Substratkonzentrationen) wurden optimiert und etabliert. Verschiedene Verfahren zur Reinigung der L-Aspartat-N-Acetyltransferase aus Rinderhirn wurden detailliert untersucht und verifiziert. Es wird die Kombination von preparativer Ultrazentrifugationsreinigung, Reinigung von membranassoziierten Proteinen, Solubilisierung und anschliessender chromatographischen Trennung (Ionenaustauscher - und Affinitätschromatographien) empfohlen, um angereicherte, aus den Hirnmikrosomen isolierte, L-Aspartat-N-Acetyltransferase zu gewinnen. Mittels Gelfiltration wurde das hohe relative Molekulargewicht der L-Aspartat-N-Acetyltransferase von 316 kDa bestimmt. <br /> Zum ersten Mal wurde eine L-Aspartat-N-Acetyltransferaseaktivität in eukaryontischen Zelllinien festgestellt sowie die Spezifität der L-Aspartat-N-Acetyltransferase - Reaktion in Mastzellen mittels Aspartoacylase – Hydrolyse des gebildeten N-Acetyl-L-Aspartats nachgewiesen. Durch diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation und Leitenzymaktivitätsbestimmung wurde die subzelluläre Lokalisation der L-Aspartat-N-Acetyltransferase in den Mitochondrien der humanen Mastzellen bestimmt. Die Ergebnisse deuten auf die Existenz von zwei Acetyltransferase- Isoenzymen hin, welche in den jeweiligen Geweben / Organen voraussichtlich unterschiedlich lokalisiert sind: ein typisches für das Nervengewebe, enthalten in den Mikrosomen der Neuronen als ein intergralles Membranprotein, und ein zweites, welches wahrscheinlich in den meisten Geweben repräsentiert ist und an den mitochondrialen biochemischen Reaktionen teilnimmt. Zum ersten Mal wird aufgezeigt, dass die L-Aspartat-N-Acetyltransferase sich in den Mikrosomen des Hirns befindet, wobei das Enzym eine mindestens 30mal höhere Aktivität als die bis dahin für die Mitochondrien des Nervengewebes veröffentlichte aufweist. Die in dem Nervengewebe festgestellte sowohl mikrosomale als auch mitochondriale Acetyltransferaseaktivität erlaubt die Vermutung, dass es eine L-Aspartat-N-Acetyltransferasefamilie gibt, deren Mitglieder das Aspartat ausgehend vom Acetylcoenzym A in unterschiedlichen Kompartimenten kovalent modifizieren. Die Erforschungen der L-Aspartat-N-Acetyltransferase leisten einen Beitrag, um die materielle Basis der Hirnprozesse und deren Physiologie zu klären, neurodegenerative Krankheiten besser zu interpretieren und erfolgreiche Interventionsstrategien und Behandlungen zu entwickeln.