Wirkung von Cannabinoiden und von short interfering RNA auf Cannabinoid-CB₁- und µ-Opioid-Rezeptoren

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden zum einen methodische Experimente durchgeführt, um bestehende Methoden zur Aufbereitung von Membranfraktionen zu optimieren, und zum anderen Radioligand-Bindungs-Experimente, die die Ermittlung der Bindungseigenschaften von CB₁-Rezeptor-Liganden an CB₁-Rezeptoren und µ-Opioid-Rezeptoren zum Ziel hatten. Ein weiteres Ziel bestand darin, die CB₁-Rezeptor-Expression in NG 108-15 Zellen durch "Gene Silencing" gezielt zu hemmen.<br /> Bei der Austestung von zwei Methoden zur Präparation des zerebralen Kortex der Maus ergab sich eine geringe Zunahme der Agonist-stimulierten [³⁵S]-GTPγS-Bindung am CB₁-Rezeptor für die Methode, bei der das Hirngewebe vor der Homogenisierung mit einem Potter-Elvehjem Homogenisator zusätzlich bei -80 °C schockgefroren und anschließend gemörsert wurde.<br /> Die Austestung von zwei unterschiedlichen Homogenisierungsschritten während der Membranpräparation des zerebralen Kortex der Maus (Potter-Elvehjem Homogenisator alleine oder zusätzlich mit Ultra-Turrax) ergab keine Unterschiede für die Bindungseigenschaften (K_D und B_max) von [³H]-SR 141716A am CB₁-Rezeptor, die in homologen Kompetitions-Experimenten unter Verwendung beider Membranpräparationen in parallelen Versuchsansätzen ermittelt wurden. Beide Membranpräparationen können daher zur Proteingewinnung für Bindungsstudien am CB₁-Rezeptor als adäquat betrachtet werden.<br /> Die Ergebnisse der Radioligand-Kompetitions-Experimente mit dem selektiven CB₁-Rezeptor-Antagonisten/-inversen Agonisten [³H]-SR 141716A am CB₁-Rezeptor des zerebralen Kortex des Meerschweinchens zeigen, dass alle untersuchten Cannabinoide durch eine kompetitive Hemmung [³H]-SR 141716A aus seiner spezifischen Bindung verdrängen. Die Affinitäten der untersuchten Cannabinoide am CB₁-Rezeptor des Meerschweinchens betrugen in absteigender Reihenfolge: SR 141716A 8,72 ± 0,06 (pK_D), VCHSR 8,11 ± 0,07 (pK_i), Δ9-THC 6,62 ± 0,02 (pK_i) und CBD 5,53 ± 0,10 (pK_i). Die Affinitäten von [³H]-SR 141716A am CB₁-Rezeptor des zerebralen Kortex von Meerschweinchen und Maus, die beide durch homologe Kompetitions-Experimente bestimmt wurden, sind einander sehr ähnlich (1,90 ± 0,35 nM versus 3,5 ± 0,7 nM).<br /> Bei der Untersuchung des Einflusses des CB₁-Rezeptor-Antagonisten/-inversen Agonisten SR 141716A und des neutralen CB₁-Rezeptor-Antagonisten VCHSR auf das Ausmaß der [³⁵S]-GTPγS-Bindung an tonisch aktiven CB₁-Rezeptoren des Meerschweinchen Hippocampus wurde gefunden, dass die basale [³⁵S]-GTPγS-Bindung durch SR 141716A gehemmt, durch VCHSR nicht beeinflusst und durch den Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN 55,212-2 gesteigert wurde. Obwohl VCHSR die agonistische Wirkung von WIN 55,212-2 stark verminderte, zeigte es gegenüber der invers agonistischen Wirkung von SR 141716A nur eine angedeutete (nicht signifikante) Abschwächung.<br /> Mithilfe verschiedener Radioligand-Bindungs-Experimente mit dem selektiven µ-Opioid-Rezeptor-Agonisten [³H]-DAMGO konnte eine allosterische Modulation der orthosterischen Bindung von [³H]-DAMGO durch die Cannabinoide CBD und Δ⁹-THC nachgewiesen werden, wobei beide Verbindungen zu einer konzentrationsabhängigen Beschleunigung der Dissoziations-Geschwindigkeit von [³H]-DAMGO am µ-Opioid-Rezeptor führten (1218,0 ± 193,1 % versus 180,6 ± 1,0 % der Dissoziations-Geschwindigkeit der Kontrollkurve in Abwesenheit der Cannabinoide). Für SR 141716A wurde keine Beschleunigung der Dissoziationskinetik von [³H]-DAMGO, aber trotzdem eine konzentrationsabhängige Verdrängung der spezifischen [³H]-DAMGO-Bindung in Pseudo-Kompetitions-Experimenten gefunden (IC₅₀ = 4,72 ± 0,91 µM), bei der es sich vermutlich um eine kompetitive Interaktion an der orthosterischen Bindungsstelle des µ-Opioid-Rezeptors mit [³H]-DAMGO handelt. VCHSR zeigte weder eine Beschleunigung der Dissoziationskinetik von [³H]-DAMGO noch eine Verdrängung der spezifischen [³H]-DAMGO-Bindung in den Pseudo-Kompetitions-Experimenten.<br /> In NG 108-15 Zellen bewirkte eine siRNA, die gegen die mRNA des CB₁-Rezeptors der Ratte gerichtet ist, keine Abnahme der CB₁-Rezeptor-Expression nach einer Zeitdauer von 120 Stunden nach der Transfektion. Der in den Western Blots verwendete Antikörper gegen den CB₁-Rezeptor der Ratte kann für die Bestimmung der CB₁-Rezeptor-Expression verwendet werden. Die Spezifität des Antikörpers wurde mit parallel untersuchten Proteinproben des zerebralen Kortex der Ratte verifiziert.<br /> Schließlich wurde im Hinblick auf eine zukünftig geplante transiente Transfektion von HEK 293 Zellen mit hCB₁-Rezeptor-cDNA überprüft, ob eine bestimmte Versuchsvorschrift die Transfektion grundsätzlich erlaubt. Durch den Nachweis der spezifischen Bindung des selektiven Serotonin 5-HT_3A-Rezeptor-Antagonisten [³H]-GR 65630 an Membranhomogenaten von transient transfizierten HEK 293 Zellen konnte der Nachweis erbracht werden, dass das verwendete Transfektionsprotokoll in der Tat geeignet ist, einen plasmidgebundenen Rezeptor transient in HEK 293 Zellen zu transfizieren.