Genetic transformation of two high oleic Helianthus annuus L. genotypes using different transformation methods

Abstract

Stable transformation of two high oleic (HO) H. annuus L. genotypes, cv.capella and SWSR2 inbred line was achieved by different transformation methods. For this, a rapid and efficient regeneration system via direct organogenesis of both genotypes has been developed. Split shoot apices explants were incubated on two different shoot induction media. Shoots from meristem adjacent tissue regenerated within 3 weeks, without a callus phase. The highest shoot induction frequency amounted to 56-70% and was observed on SIM2 medium containing Murashige and Skoog (MS) salts 4.3 g/L, myo-inositol 0.56 mM, thiamine-HCl 0.30 µM, glycine 26.6 µM, nicotinic acid 4.1 µM, pyridoxine-HCl 2.4 µM, sucrose 3% and 6-benzylaminopurine (BAP) 0.4 µM. A high rooting efficiency (60-90%) was achieved independent of genotype and rooting media. Regenerated plantlets were successfully elongated on hormone free medium. Acclimatized plantlets showed further development reaching the flowering stage and seed production. On the basis of the developed tissue culture protocol, various transformation strategies [Agrobacterium infiltration, combined Agrobacterium infiltration with wounding systems (microprojectles and glass beads), Agrobacterium injection and biolistic gene delivery] were compared by estimating the transformation frequency of each using the gus reporter gene. Several parameters affecting Agrobacterium infiltration method (different vacuum durations, A. tumefaciens strains, bacterial densities, type of explants, co-cultivation media, virulence inducers, co-cultivation durations and pre-culture periods), microprojectiles wounding (different tungsten particle sizes and particle acceleration pressures), glass bead wounding (different speeds and durations of agitation), Agrobacterium injection (different injection capillary sizes), biolistic gene delivery (different gold particles sizes, particle acceleration pressures, distances between macrocarrier assembly and target plate, pre-culture durations of the explant and number of bombardments per explant) were optimized. These parameters were evaluated on the basis of histochemical and fluorometric GUS activity coupled with regeneration frequency and efficiency as well as plant cell vitality. This study has demonstrated for the first time that most tested transformation methods can be successfully used to transform high oleic H. annuus L. genotypes, cv.capella and SWSR2 inbred line without using selection system. However, the recorded transformation frequency (based on PCR analysis) varied among the different methods and ranged from 1.7 to 4% and from 0.9 to 4.5% in cv.capella and SWSR2 inbred line, respectively. Agrobacterium infiltration and biolistic gene delivery were found to be the most efficient transformation methods for cv.capella and SWSR2 inbred line, respectively. Mgfp5 gene has proved to be a suitable reporter of early transformation events. Moreover, using the optimized transformation protocols combined with mgfp5 gene for the transformation of high oleic H. annuus L. genotypes, cv.capella and SWSR2 inbred line, reduced the transformation frequencies to 3.3% for both genotypes compared to gus gene. Histochemical, fluorometric, histological as well as molecular analysis confirmed the presence and integration of the transgene into sunflower genome and the transmission to the next generation. Southern blot analysis showed insertion of a single or multiple copies of the transgene into the genome of selected T0 and T1 plants.

<strong>Genetische Transformation von zwei hoch-ölsäurehaltige Helianthus annuus L. Sorten mittels unterschiedlicher Transformationstechniken</strong><br /> Die stabile Transformation des hoch ölsäurehaltigen (HO) F1-Hybriden cv. Capella und der HO Inzuchtlinie SWS-R2 konnte durch verschiedene Transformationsmethoden erzielt werden. Hierzu wurde zunächst für beide Genotypen ein schnelles und effizientes Regenerationssystem über direkte Embryogenese entwickelt. Dazu wurden geteilte Sprossspitzen als primäre Explantate auf zwei verschiedenen Sprossinduktionsmedien inkubiert. Innerhalb von drei Wochen konnten junge Sprosse aus den meristematischen Zonen ohne eine Kallusphase regeneriert werden. Die höchste Sprossinduktionsrate von 56-70% konnte hierbei mit SIM2 Medium beobachtet werden, bestehend aus 4,3 g/l MS Salze, 0,56 mM myo-Inositol, 0,30 µM Thiamin-HCl, 26,64 µM Glycin, 4,1 µM Nicotinsäure, 2,43 µM Pyridoxin-HCl, 3% (w/v) Saccharose, 0,44 µM BAP und 6 g/l Plant-Agar. Eine hohe Bewurzelungsrate von 60-90% konnte bei beiden Genotypen unabhängig vom verwendeten Bewurzelungsmedium erzielt werden. Die regenerierten Pflanzen konnten anschließend auf hormonfreiem Medium großgezogen werden. Aus den akklimatisierten in vitro Pflanzen konnten fertile Blüten und Samen erzeugt werden. Auf der Basis des bestehenden Regenerationsprotokolls konnten verschiedene Transformationstechniken wie die Agrobacterium-Infiltration, die kombinierte Agrobacterium-Infiltration durch Verwundung der Pflanzen mittels Mikroprojektilen und Glaskugeln, sowie der Agrobacterium Injektion in Verbindung mit der biolistischen Transformationstechnik (Gene Gun) über die Transformationsfrequenz des eingeführten gus Gens verglichen werden. Hierbei wurden zahlreiche Tranformationsparameter optimiert und deren Transformations – Effizienz sowohl über histochemische und fluorometrische GUS Assays als auch über Parameter der pflanzlichen Zell und Gewebekultur evaluiert. In dieser Arbeit konnte dabei gezeigt werden, dass die meisten Transformationstechniken zur erfolgreichen Transformation der hoch ölsäurehaltigen (HO) Helianthus annuus Genotypen cv. Capella und SWS-R2, ohne eine Selektion der Transformanten, herangezogen werden können. Dennoch konnte mittels PCR-Analyse zwischen den evaluierten Transformations-Methoden und den verwendeten Genotypen hinsichtlich der Transformationseffizienz Unterschiede beobachtet werden. Mittels der Agrobacterium-Infiltration über ballistische Mikropartikel konnten in beiden Genotypen die höchsten Transformationsraten erzielt werden. Zusätzlich konnte mit Verwendung des mgfp5 Gens ein praktikables Marker- und Reportersystem für Helianthus annuus etabliert werden, welches zur sicheren Überprüfung früher Transformationsereignisse herangezogen werden kann. Jedoch führte die Verwendung des optimierten Transformationsprotokolls in Verbindung mit dem mgfp5 Reporter Gens im Vergleich zum gus Reporter Gen zu einer reduzierten Transformationsrate in beiden Genotypen. Durch die histochemischen, fluorometrischen und molekularen Analysen konnte die erfolgreiche Integration des Transgens in die beiden Helianthus Genotypen sowie auch in deren Nachkommenschaft bestätigt werden. Eine Southern-Blot Analyse konnte darüber hinaus sowohl eine singuläre als auch multiple Integration des Transgenes in das Genom selektierter T0 und T1 Pflanzen aufzeigen.