Spermidin Metabolismus in <i>Plasmodium falciparum </i>und<i> Plasmodium vivax</i>

Abstract

Im Rahmen der Arbeit wurde der Spermidin Metabolismus in <i>Plasmodium falciparum</i> und <i>Plasmodium vivax</i> molekularbiologisch und biochemisch untersucht. Ziel war es mögliche "molekulare Targets" für neue Chemotherapeutika gegen Malaria zu identifizieren und analysieren. <br /> Durch ein Inhibitorexperiment mit Dicyclohexylamin (DCA) und anschließender Supplementation von exogenem Spermidin erfolgte der indirekte Nachweis, dass es eine Spermidinsynthase (SPS) in <i>P. falciparum</i> gibt. Inzwischen konnte die Spermidinsynthase des <i>P. falciparum</i> 3D7 Stammes von Luersen et al. (2000) erfolgreich kloniert und deren Funktion nachgewiesen werden. Weiterhin ließen die durch die Inhibitorstudie mit 1,7-Diaminoheptan (DAH) erhaltenen Ergebnisse sowie der Genbankeintrag einer Deoxyhypusinsynthase (DHS)codierenden Genregion in <i>P. falciparum</i> (Molitor et al., 2000/ Gardner et al., 2002), den Schluss zu, dass eine DHS in <i>P. falciparum</i> existiert. Aufgrund der Inhibitionsexperimente mit Agmatin und einer nachfolgenden GC/MS Analyse, bei der erstmalig Homospermidin in <i>P. falciparum</i> nachgewiesen wurde, wurde das Vorliegen einer separaten Homospermidinsynthase (HSS)vermutet. <br /> Weitere Inhibitorexperimente wurden durchgeführt, um den inhibitorischen Effekt von Agmatin in <i>in vitro</i> Kulturen von <i>P. falciparum</i> Stämmen mit neueren Chemotherapeutika, Artemisinin und Triclosan, sowie dem konventionellen Chloroquin, zu vergleichen. Die Ergebnisse dieser Experimente machen deutlich, dass die Inhibitoren Agmatin und Artemisinin eine bessere Selektivität und größere Toxizität, im Gegensatz zu Chloroquin und Triclosan besitzen. Außerdem zeigte ein Vergleich der Effizienz von Artemisinin und Agmatin auf die Entwicklungsstadien des Parasiten, dass beide Hemmstoffe gegen alle erythrozytären Stadien aktiv waren. <br /> Eine weitere Fragestellung, die in unseren Experimenten untersucht wurde, war der Effekt von Agmatin auf die Biosynthese der zellulären RNA im Vergleich zu Triclosan, Artemisinin und Chloroquin. Bei einer Konzentration von 200 µM Agmatin und 2 µM Triclosan konnte kein Unterschied im Vorkommen und in dem Muster der zwei prominenten RNA Spezies 19S und 26S ribosomaler RNA (rRNA) in Bezug auf den Chloroquin-sensitiven (CQS) und die Chloroquin-resistenten (CQR) Stämme beobachtet werden. Im Fall von Artemisinin und Chloroquin konnte weder beim NF54 - Stamm, noch bei dem R - (CQR) und Dd2 - (CQR) Stamm nach 24 Stunden rRNA isoliert werden.<br /> In dieser Arbeit konnten zwei Proteine, die bislang noch nicht für den Parasiten beschrieben waren, als mögliche neue Zielstrukturen identifiziert werden. Zum einen konnte eine DHS/HSS codierende Genregion aus dem <i>P. falciparum</i> NF54 - Stamm isoliert, sequenziert und exprimiert werden. Die isolierte DHS/HSS Genregion besitzt eine Größe von 1491 bp und codiert ein Protein mit einer Größe von 467 Aminosäuren.<br /> Das Protein konnte exprimiert werden, dessen spezifische Aktivität gemessen und auch die Bifunktionalität (Deoxyhypusinsynthaseaktivität/ Homospermidinsynthaseaktivität) dieses Enzyms gezeigt werden (Hammels et al., 2004).<br /> Das zweite Protein, dass identifiziert wurde, ist der eukaryontische Translations-initiationsfaktor 5A aus <i>P. vivax</i>. Auch dieses Protein konnte isoliert, sequenziert und exprimiert werden. Die erhaltene eIF5A Sequenz von <i>P. vivax</i> (Salvador I Stamm) besitzt einen offenen Leserahmen von 486 bp und codiert ein Protein in der Größe von 162 Aminosäuren. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kreuzreaktion zwischen dem exprimierten eIF5A Protein und dem homologen NeIF5A aus Nicotiana plumbaginifolia (Solanaceae) mit einem polyklonalen Antikörper bestand. Dies deutet daraufhin, dass sich eIF5A aus <i>P. vivax</i> aus einer höheren Pflanze rekrutiert. In der Zukunft soll mit den überexprimierten Proteinen biologische Testsysteme aufgebaut werden, um auf potenzielle Inhibitoren zu testen. Hierfür könnten auch pflanzliche Extrakte traditioneller Arzneipflanzen, die gegen Fieber wirksam sind, zum Einsatz kommen. Außerdem soll mit Hilfe eines Versuchs zum Gensilencing von eIF5A, durch die Darstellung einer eIF5A Mutante mit Hilfe der siRNA Technik, in fortführenden Experimenten dessen Bedeutung in der Zellproliferation näher untersucht und charakterisiert werden.

<strong>Spermidine metabolism in <i>Plasmodium falciparum</i> and <i>Plasmodium vivax</i> - biochemical and biomolecular investigation of the deoxyhypusine synthase and the eukaryotic translation initiation factor 5A</strong><br /> In the present study the spermidine metabolism in <i>Plasmodium falciparum</i> and <i>Plasmodium vivax</i> was investigated on a biochemical and biomolecular level. The aim was to identify and analyse possible "molecular targets" for new chemotherapeutic agents against malaria. <br /> Inhibitor studies with dicyclohexylamine (DCA) and following supplementation with exogenous spermidine delivered an indirect proof that a spermidine synthase (SPS) exists in <i>Plasmodium falciparum</i>. In the meantime the spermidine synthase of the <i>P. falciparum</i> strain 3D7 has been successfully cloned and its function shown by Luersen et al., (2000). Furthermore the results received by an inhibitor study with 1.7-Diaminoheptane (DAH) as well as the gene bank entry of a deoxyhypupusine synthase (DHS) coding gene region in <i>P. falciparum</i> (Molitor et al., 2000/ Gardner et al., 2002), lead to the conclusion that a DHS in <i>P. falciparum</i> exists. Due to the inhibitor experiments with agmatine and a following GC/MS analysis, the existence of homospermidine in <i>P. falciparum</i> was shown for the first time, and lead to the assumption that a separate Homospermidine synthase (HSS) is present. <br /> Further inhibitor experiments were carried out, in order to compare the inhibitory effect of agmatine in <i>in vitro</i> cultures of <i>P. falciparum</i> strains with newer chemotherapeutic agents, such as artemisinine and triclosan, as well as the conventional chloroquine. The results of these experiments showed that the inhibitors agmatine and artemisinine possess a better selectivity and a greater toxicity, in comparison to chloroquine and triclosan. In addition a comparison of the efficiency of artemisinine and agmatine showed that both inhibitors were active against all erythrocytic stages of the parasite. <br /> A further question, which was examined in our experiments, was the effect of agmatine on the biosynthesis of cellular RNA compared to triclosan, artemisinine and chloroquine. With a concentration of 200 µM agmatine and 2 µM triclosan no difference in the occurrence and the pattern of the two prominent RNA species 19S and 26S of the ribosomal RNA (rRNA) in respect to the chloroquine sensitive strain (CQS) and the chloroquine resistant strains (CQR)could be observed. In the case of artemisinine and chloroquine rRNA could not be isolated after 24 hours from any of the strains. <br /> In this study two proteins, which have so far not yet been described for the parasite, were identified as possible new target structures. On the one hand a DHS/HSS coding gene region from the <i>P. falciparum</i> NF54 - strain was isolated, sequenced and expressed. The isolated DHS/HSS gene region possesses a size of 1491 bp and codes a protein with a size of 467 amino acids. The protein was expressed, its specific activity measured and shown to be a bifunctional enzyme (deoxyhypusine synthase activity/ homospermidine synthase activity) (Hammels et al., 2004). <br /> The second protein to be identified, was the eukaryotic translation initiation factor 5A from <i>P. vivax</i>. The protein was isolated, sequenced and expressed. The received eIF5A sequence of <i>P. vivax</i> (Salvador I strain) possesses an open reading frame of 486 bp and codes a protein with a size of 162 amino acids. It could be shown that a cross reaction between the expressed eIF5A protein and a polyclonal antibody against the homologous NeIF5A of <i>Nicotiana plumbaginifolia</i> (Solanaceae) existed. This result suggests that eIF5A from <i>P. vivax</i> recruits itself from a higher plant. In the future biological test systems should be developed with the overexpressed proteins, in order to test potential inhibitors. Therefore extracts of traditional medicinal plants, which are effective against fever, could be employed. Furthermore the significance of eIF5A in the cell proliferation process, could be analysed with the help of an attempt to genesilence eIF5A, through the presentation of an eIF5A mutant with the help of the siRNA technique.