Untersuchungen zur Funktion von BAT3-Spleißvarianten

Abstract

BAT3 und BAT2 sind zwei benachbarte Gene in der MHC Klasse III-Region. In der vorliegenden Arbeit wurden BAT3-Spleißvarianten hergestellt und mit molekular-biologischen sowie biochemischen Methoden untersucht. Ausgehend von einem BAT3-Exon 24-Konstrukt wurden fünf BAT3-Spleißvarianten mittels PCR kloniert: BAT3-Exon 5, BAT3-Exon 11, BAT3-Exon 11b, BAT3-Exon 22 sowie ein BAT3-Volllängenkonstrukt.<br /> Um die Funktion und die Lokalisation dieser BAT3-Isoformen zu analysieren, wurden die Konstrukte transient in COS-7-Zellen exprimiert. Zunächst wurde untersucht, ob alle BAT3-Isoformen sowie das Volllängen-BAT3 kernlokalisiert sind. In Immunfluoreszenz-Analysen waren alle untersuchten Isoformen im Zellkern lokalisiert. BAT3 gehört zur Familie der BAG-Proteine, die eine Rolle als Kochaperone bei der zytoplasmatischen Degradation von Proteinsubstraten spielen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von BAT3 auf die E3-Ubiquitinligase-CHIP vermittelte Degradation des Glukokortikoidrezeptors (GR) gemessen. GR wird in Anwesenheit jeder der sechs getesteten BAT3-Isoformen und CHIP stärker degradiert, als bei alleiniger Expression von CHIP. In Koisolationsversuche wurde demonstriert, dass alle BAT3-Isoformen jeweils mit CHIP und mit dem GR interagieren können. <br /> Die Funktion des zu BAT3 benachbarten BAT2-Gens ist weitgehend unbekannt. BAT2- und BAT3-Proteine sind sehr prolinreich und werden in zahlreichen Zelltypen exprimiert. Bei der Spermatogenese werden BAT2 und BAT3 aufeinander folgend exprimiert. Es wird vermutet, dass BAT2 ein RNA Spleißfaktor ist. BAT2 könnte deshalb am differentiellen Spleißen von BAT3 beteiligt sein. Um die Funktion von BAT2 zu analysieren, wurde ein BAT2-Geninaktivierungsvektor hergestellt. Die BAT2-Geninaktivierung ist möglicherweise embryonal letal. Mit dem Ziel eine lebensfähige BAT2-defiziente Maus zu erzeugen, wurde in dieser Arbeit eine Cre/LoxP-basierte Strategie eingesetzt, mit der das BAT2-Gen konditional ausgeschaltet werden kann. Alternativ zur in vivo Geninaktivierung ist mit dem Geninaktivierungsvektor auch eine konventionelle Geninaktivierung möglich, indem der mit loxP-Sequenzen flankierte BAT2-Bereich in vitro durch die transiente Expression der Cre-Rekombinase in den homolog rekombinanten ES-Zellen entfernt wird. Die Funktionsfähigkeit der loxP-Sequenzen in der rekombinanten BAT2-DNA konnte mit Hilfe von Cre-Rekombinase-ausprägenden E. coli-Bakterien gezeigt werden. Transfektionen mit dem BAT2-Geninaktivierungsvektor in embryonale Stammzellen zeigten eine äußerst niedrige Rekombinationsfrequenz. Es konnten zehn homologe Rekombinanten aus 1443 ES-Klonen mittels PCR-Analyse identifiziert werden.